Name: high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

Støttet af NIH tilskud RC1-HL-101.102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​den Hartwell Fonden samt Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny er et investigator i Eric Hartwell fond og Amy Strelzer Manasevit Research Program.

1. Eksperiment Dag 0: Prøveforberedelse og ELISA Test Plate Coating med indfangningsantistof for IL-2Ra, REG3α og HGF <ol><li> Plasma alikvote prøver, der skal analyseres, vil blive trukket, optøet og centrifugeret ved 12.000 rpm i 10 min for at adskille de koagler i bunden og lipider oven fra plasmaet. 150 gl af ufortyndet plasma vil blive udpladet fra hver prøve på en 96-brønds V-bundplade (kilde plade) ved manuel pipettering efter foruddefinerede kort. Alikvoterne vil blive pakket ind i parafilm og holdt i et fugtigt kammer ved 4 ° C under hele processen, ikke længere end 72 timer. </li><li> IL-2Ra og HGF indfangnings-antistoffer vil blive rekonstitueret og fortyndet pr producent specifikation og 50 pi vil udpladet i hver brønd i respektive 96-brønds høj-bindende halv-brønds plader, som så forsegles og inkuberes natten over ved 4 ° C. Alternativt kan mange plader tørres ved 37 ° C og opbevaret ved 4 ° C til senere brug, afhængerING på stabiliteten af ​​proteinet. </li><li> REG3α indfangende antistof vil blive fortyndet i overensstemmelse med producentens protokol under anvendelse af producentens coating puffer og 25 ul vil blive udpladet i hver brønd af en 384-brønds Nunc Maxi-Sorp plade, som derpå forsegles og inkuberes natten over ved 4 ° C. </li></ol> 2. Eksperiment Dag 1: IL-2Ra ELISA (figur 1) <ol><li> The IL-2Ra test Pladen vaskes, blokeres med BLOTTO i TBS, og standarden rekonstitueres og en 8-punkts standardkurve fremstilles pr producent protokol. </li><li> Efter vask af pladen som følge af blokering trin 50 pi ufortyndet plasma udpladet in duplo fra kilden pladen til ELISA plade, og 50 pi af hver standard er udpladet in duplo. Pladen forsegles og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur på en plade rotator indstillet til 300 opm. </li><li> Plasmaet opsamles på IL-2Ra ELISA plade og placeres tilbage i unfortyndet plasmakilde plade. ELISA er afsluttet pr fabrikanten protokol (med volumener justeret til halv-brønds plader) og den optiske densitet af hver brønd vil blive læst ved hjælp af en pladelæser sat til 450 til 570 nm, og dataene lagres og analyseres. </li></ol> 3. Eksperiment Dag 1: REG3α ELISA (figur 1) <ol><li> 10 gl ufortyndede plasma overføres til et separat v-bottom source plade. 90 pi af fabrikantens-billede fortyndingsbufferen sættes til hver brønd for at skabe en 1:10 fortynding kilde plade. </li><li> Den REG3α ELISA udføres per producent protokol (med volumener justeret for 384-brønds plader) og den optiske densitet af hver brønd vil blive læst med en pladelæser sat til 450-620 nm, og dataene vil blive gemt og analyseret. </li></ol> 4. Eksperiment Dag 1: Elafin og TNFR1 Test Plate Coating med Capture Antibody <ol><li> Elafin og TNFR1 capture-antistoffer vil blive rekonstitueret og fortyndetudloddet pr producent specifikation og 50 pi vil udpladet i hver brønd i respektive 96-brønds høj-bindende halv-brønds plader, som så forsegles og inkuberes natten over ved stuetemperatur i Elafin, og ved 4 ° C i TNFR1. </li></ol> 5. Eksperiment Dag 1-2: HGF ELISA (figur 1) <ol><li> Efter færdiggørelse af IL-2Ra ELISA og sikrer det ikke nødvendigt at gentage, vil 60 ul ufortyndet plasma overføres til en ny kilde plade og derefter 60 pi af 1% BSA i 1 x PBS sættes til hver brønd for at foretage en 1:02 fortyndet plasma source plade. </li><li> HGF test Pladen vaskes, blokeres med BLOTTO i TBS, og standarden rekonstitueres og en 8-punkts standardkurve fremstilles pr producent protokol. </li><li> Efter vask af pladen som følge af blokering trin 50 pi 1:02 fortyndet plasma udpladet in duplo på ELISA-testpladen, og 50 pi af hver standard er udpladet in duplo. Pladen forsegles, oginkuberet natten over ved stuetemperatur på en plade rotator indstillet ved 300 RPM. </li><li> 1:2 fortyndede plasma opsamles på HGF ELISA plade og føres tilbage i 1:2 fortyndede plasma source plade. ELISA er afsluttet pr fabrikanten protokol (med volumener justeret til halv-brønds plader) og den optiske densitet af hver brønd vil blive læst ved hjælp af en pladelæser sat til 450 til 570 nm, og dataene lagres og analyseres. </li></ol> 6. Eksperiment Dag 2: Elafin ELISA <ol><li> 10 gl ufortyndede plasma vil blive overført til en ny kilde plade og derefter 190 pi af 1% BSA i 1 x PBS sættes til hver brønd for at gøre 200 pi plasma dluted 1:20. </li><li> The Elafin ELISA som udført ifølge producentens protokol (med volumener justeret til halv-brønds plader), og den optiske densitet af hver brønd vil blive læst ved hjælp af en pladelæser sat til 450 til 570 nm, og dataene lagres og analyseres. </li></ol> 7. Eksperiment Day 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 ul 1% BSA i PBS sættes til 01:20 source plade (nu indeholdende 100 ul 01:20 plasma) til opnåelse af 125 pi 1:25 fortyndet plasma. </li><li> The TNFR1 ELISA er afsluttet pr fabrikanten protokol (med volumener justeret til halv-brønds plader) og den optiske densitet af hver brønd vil blive læst ved hjælp af en pladelæser sat til 450 til 570 nm, og dataene lagres og analyseres. </li></ol> 8. Eksperiment Dag 2: IL-8 ELISA <ol><li> 60 pi 1:02 fortyndet plasma vil overført til en ny kilde plade og derefter 180 ul IL-8 fortyndingsmiddel tilsættes til hver brønd for at gøre en 1:06 fortyndet plasma source plade. </li><li> IL-8 ELISA er afsluttet pr producenten protokol (med volumener justeret til halv-brønds plader) og den optiske densitet af hver brønd vil blive læst ved hjælp af en pladelæser sat til 450 til 570 nm, og dataene lagres og analyseres. </li></ol> Når alle ELISA&#39;er er afsluttet, unused stock plasma erstattes i de optøede alikvoter og frosset til senere brug.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

<html> Den sekventielle ELISA-metode præsenteres her muliggør måling af flere plasmaproteiner på små volumener af plasma, som kan være vanskeligt at opnå og / eller uerstattelige, såsom prøver fra humane individer med sjældne sygdomme eller plasmaprøver opnået fra mus 9,10. De sekventielle ELISA&#39;er udføres typisk i rækkefølge efter stigende plasma fortyndingsfaktor, med ELISA&#39;er kræver plasma fortyndet ≥ 1:10 typisk ikke behøver at blive regenereret, selv om dette kan gøres om ønsket. Evnen til at udføre sekventiel ELISA er begrænset af ELISA kits / protokoller, hvori plasmaet blandes med andre reagenser eller som forskellige fortyndings buffere er nødvendige for plasma, hvilket udelukker ablility at genbruge en prøve på grund af frygt for, at en inkompatible buffer / reagens vil forstyrre udførelsen af ​​en bestemt test. Med omhyggelig planlægning, kan 10 eller flere ELISA&#39;er skal udføres på samme plasmaprøve. ENT &quot;&gt; Individuelle laboratorier kan være nødvendigt at justere plasma fortyndinger for at få fortolkelige resultater baseret på de forventede plasmakoncentrationer af proteinet af interesse i prøverne fra forsøgspersonerne. Forskelle i laboratorieudstyr kan resultere i et behov for at optimere inkubation og kolorimetriske udvikling tider, antal vaske-og / eller vaske sættetider for at optimere en given ELISA. At øge high-throughput kapacitet og nøjagtigheden og at udføre analyser på en omkostningseffektiv måde, er anvendelsen af ​​en robot væskehåndtering platform stand til analyse af 384-brønds plader og en automatisk pladevasker med stableenhed anbefales. Dette udstyr kan øge nøjagtigheden og præcisionen af ​​analyse udført af flere brugere, og bidrage til at give sammenhæng analyse for at reducere inter-og intra-assay variation. Vi brugte sekventiel ELISA løbet tilgængelige multipleks platforme af to grunde: 1) De fleste af deantistof-par for hidtil ukendte proteiner kan ikke let konjugeres til kugler eller andet materiale samt tidskrævende og dyre, 2) individuelle ELISA-assays er mere præcise end multiplex microarray eller perler, sekundært til et fravær af krydsreaktivitet 11. Hvis en pålidelig metode er etableret til at udføre multipleksede, kugle-baserede microarrays, kan det være i stand til at erstatte den sekventielle ELISA-processen, men kan være begrænset af evnen til at konjugere antistofferne til perler og / eller antallet af proteiner, der ønskes analyseres.

Akut graft-versus-vært sygdom (GVHD), en førende årsag til ikke-tilbagefald dødelighed (NRM) efter allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT), måles ved dysfunktion i tre organsystemer: hud, lever og gastrointestinal (GI) tarmkanalen 4. Akut GVHD forekommer typisk mellem to og otte uger efter transplantation men kan forekomme senere, og er ofte klinisk ikke kan skelnes fra andre post-HSCT komplikationer såsom conditioning regimen toksicitet, infektion eller medicin bivirkninger. Ved anvendelse af proteom strategier og high-throughput validering med sekventiel ELISA har vi identificeret seks proteiner, hvis koncentrationer forhøjet ved de kliniske manifestationer af GVHD. IL-2Ra, TNFR1, HGF og IL-8, når de kombineres i en 4-biomarkør panel kan diagnosticere GVHD ved indtræden af kliniske symptomer og kan forudsige post-HSCT overlevelse uafhængigt af GVHD sværhedsgrad 1. Elafin, en biomarkør for GVHD af ski, kan skelne mellem GVHD udslæt og udslæt af andre årsager, såsom narkotika udbrud og kan forudsige transplantation overlevelse 2. Vi har for nylig identificeret REG3α som biomarkør for GVHD af den nedre mavetarmkanal, målorganet mest forbundet med NRM. Plasma REG3α koncentration pålideligt kan identificere GVHD som årsag til post-HSCT diarré og korrelere til histologisk sværhedsgraden af ​​GVHD på diagnostiske tarmbiopsier. REG3α koncentrationer ved GI GVHD indtræden kan også forudsige reaktion på GVHD terapi og NRM 3. Indarbejdelsen af ​​disse validerede GVHD biomarkører i klinisk pleje i øjeblikket ved at blive undersøgt i kliniske forsøg. Disse forsøg blev udført på små plasma prøver indsamlet fra patienter, der fik HSCT mellem 2000 og 2010 på tidspunktet for GVHD debut som er uerstattelige og af begrænset mængde. På grund af den værdifulde beskaffenhed af disse prøver, har vi udviklet en method at måle multiple plasma proteinkoncentrationer på en effektiv og reproducerbar måde at fjerne overskydende fryse-tø cykler, tø tid og plasma brug. Denne teknik kan anvendes til at udføre ELISA&#39;er for multiple proteiner / cytokiner af interesse på den samme prøve (r), forudsat prøverne ikke behøver at blive blandet med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med præ-coatede plader, 96 brønde halv-brøndsplader eller 384-brønds plader kan anvendes for yderligere at minimere brug af prøver / reagenser. Dette håndskrift fokuserer på de teknologiske aspekter af måling af GVHD biomarkører.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Human IL-2 R alpha DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> Human HGF DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> Human IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550.999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match ASSEMBLY Humant PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig sTNFRI/TNFRSF1A DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Menneskelig Trappin-2/Elafin DuoSet </td><td> R &amp; D Systilke </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brønds polystyrenplader koniske bundplader </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249.570 </td><td> Bruges til plasma kilde plader </td></tr><tr><td> Costar halv-brønds high-bindende 96-brøndsplader </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> For IL-2Ra, HGF, TNFR1 og elafin ELISA&#39;er </td></tr><tr><td> NUNC 384-well MaxiSorp-plader </td><td> Nunc </td><td> 464.718 </td><td> For REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone phosphatbufret saltvand, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin, fraktion V, varmebehandlet Shock </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker BLOTTO i TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37.530 </td><td> Blokerende middel for IL-2Ra HGF og TNFR1 ELISA&#39;er </td></tr><tr><td> DulbeccosPhosphatpufret saltvand </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> Vaskebuffer til IL-2Ra, HGF, Elafin og TNFR1 ELISA&#39;er </td></tr><tr><td> TMB Peroxide Susbtrate </td><td> Kirkegaard and Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> Vaskebuffer til IL-2Ra, HGF, Elafin og TNFR1 ELISA&#39;er </td></tr><tr><td> Svovlsyre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84.720 </td><td> (Fortyndet til 2N) for stop løsning </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Unbiased discovery proteomics strategier har potentiale til at identificere et stort antal hidtil ukendte biomarkører, der kan forbedre diagnostisk og prognostisk test i et klinisk miljø, og kan vejlede terapeutiske indgreb. Når et stort antal kandidat proteiner er identificeret, kan det være vanskeligt at validere kandidat biomarkører i en rettidig og effektiv måde fra patient plasmaprøver, der er event-driven, af finite volumen og uerstattelige, såsom ved begyndelsen af ​​akut graft-versus- værtssygdom (GVHD), en potentielt livstruende komplikation ved allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT). Her beskrives processen med at udføre kommercielt tilgængelige ELISA&#39;er for seks validerede GVHD proteiner: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2 og REG3α 3 (også kendt som PAP1) i en sekventiel måde for at minimere fryse-tø cykler, Optøet plasma tid og plasma brug. For denne procedure, vi udfører ELISA-test i rækkefølge som bestemt ved prøve fortyndingsfaktor som fastlagt i vores laboratorium ved brug af producenten ELISA kits og protokoller med mindre justeringer for at lette optimal sekventiel ELISA ydeevne. De resulterende plasma biomarkør koncentrationer kan derefter indsamles og analyseres for væsentlige resultater inden for en patient kohorte. Mens disse biomarkører er i øjeblikket kun beregnet til research, er deres integration i klinisk pleje i øjeblikket ved at blive undersøgt i kliniske forsøg. Denne teknik kan anvendes til at udføre ELISA&#39;er for multiple proteiner / cytokiner af interesse på den samme prøve (r), forudsat prøverne ikke behøver at blive blandet med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med præ-coatede plader, 96 brønde halv-brøndsplader eller 384-brønds plader kan anvendes for yderligere at minimere brug af prøver / reagenser.

<html> Biomarkøren arbejdsgang og tidslinje er specificeret i tabel 1 og tabel 2, hhv. Når de er udført, koncentrationer af 6 forskellige proteiner er nu blevet kvantificeret på samme plasmaprøve anvendelse af i alt 150 pi plasma. Udplade prøverne i to eksemplarer per test giver mulighed for intern kvalitetssikring, med CV er mindre end 10% er optimal. Hvis der udføres den sekventielle ELISA på flere plader, ensartede optiske tætheder af den høje standard foretrækkes og muliggøre et bedre mellem plade pålideligheden af målinger, standardkurve OD&#39;erne kan sammenlignes mellem plader for at undersøge vurdere til uensartethed i ELISA-resultater (figur 2). Udviklingstiden anvender tetramethylbenzidin kolorimetrisk substrat og høj koncentration OD&#39;erne observeret for hver biomarkør i vores laboratorium, er anført i tabel 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figur 1 &quot;/&gt; Figur 1. Arbejdsgang for IL-2Ra, REG3α og HGF ELISA&#39;er. Efter plasmaprøverne er blevet udpladet på IL-2Ra ELISA testplader det regenereret at gøre fortynding kilde plader til andre ELISA&#39;er. For HGF ELISA, bliver plasmaet regenereret til fremstilling af 1:06 fortynding pladen til IL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">her for større tal</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Optiske tætheder for standardkurve for 7 forskellige ELISA-plader måler REG3α koncentrationer svarende til de 1084 patienter testet for den første REG3α GI GVHD biomarkør rapport 3. Konsekvent OD&#39;erne mellem pladerne sikre en konsekvent proteinkoncentration målinger mellem pladerne. Koncentrationer af proteineri plasma prøver beregnes ved at sammenligne prøve optiske densiteter med standardkurven optiske densiteter. <table border="1"><tbody><tr><td> Eksperiment Dag 0 </td><td> 1. Forbered prøver </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Ra, HGF og REG3α capture Ab </td></tr><tr><td> Eksperiment Dag 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (gennem prøven plating) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin og TNFR capture Ab </td></tr><tr><td> Eksperiment Dag 2 </td><td> 1. HGF ELISA færdiggørelse </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Fryses igen ubrugtplasma </td></tr></tbody></table> Tabel 1. GVHD Biomarker Workflow Oversigt <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Dag 0 </td><td colspan="3"> Prøveforberedelse og overnatning capture krop inkubation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Ra </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Tid (timer) </td><td> 0,0 </td><td> Blokering </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Belagte prøver </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclaim plasmaprøver; Detection Ab </td><td> Blokering, fremstille prøver (1:10 fortynding) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td> Prøver belagte (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> Detection Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td> Plate Reading </td><td> TMB </td><td> Blokering, forberede prøver (1:2 fortynding) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Plate Reading </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td> Prøver belagte (1:2) </td><td> Capture Ab (inkubation natten) </td><td> Capture Ab (inkubation natten) </td><td></td></tr><tr><td> Dag 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tid (timer) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim plasma, Detection Ab </td><td> Blokering, forberede prøver (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Prøve plating (1:2) </td><td> Blokering; Yderligere fortynding på 1:20 prøver til 1:25 fortynding </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Prøve plating (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Plate Reading </td><td> Detection Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Fremstille prøver (1:06 fortynding) </td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Detection Ab </td><td> Prøve plating (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Plate Reading </td&gt; <td> HRP </td><td> Detection Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plate Reading </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plate læsning </td></tr><tr><td colspan="2"> Efter færdiggørelse </td><td colspan="6"> Udskift source plasma i aliquoter og fryse til senere brug </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Tidslinje til udførelse af ELISA&#39;er. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plasma Fortyndingsfaktor </td><td> High Standard Concentration </td><td> Substrat Development Tid (min) </td><td> High OD </td><td> Kurve </td></tr><tr><td> IL-2Ra </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Lineær </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-parameter </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Lineær </td></tr></tbody></table> Tabel 3. ELISA Detaljer for 6 GVHD biomarkører.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

High throughput validering af flere kandidat biomarkører kan udføres ved sekventiel ELISA for at minimere fryse / optøningscykler og anvendelse af kostbare plasmaprøver. Her vil vi vise, hvordan man sekventielt udføre ELISA&#39;er for seks forskellige validerede plasma biomarkører<sup&gt; 1-3</sup&gt; Af graft-versus-vært sygdom (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; På samme plasmaprøve.

High Throughput Sekventiel ELISA for Validering af biomarkører for akut graft-versus-host-sygdom

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekventiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Osteogene Stem / stamceller Under frakturreparation

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Minimal Invasive Kirurgisk Procedure inducere myokardieinfarkt i mus

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Højt gennemløb Karakterisering af voksne stamceller udviklet til levering af terapeutiske faktorer for Neurobeskyttende Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Påvisning af sygdom-associeret α-synuclein ved Enhanced ELISA i hjernen hos transgene mus overudtrykker Menneskelig A53T Muterede α-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En højt gennemløb, Multipleksede og målrettet proteomiske CSF Assay at kvantificere neurodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E Isoformer status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Undersøgelse af In Vivo glukosemetabolismen i høj-fedt kost-fed mus bruger Oral glukose Tolerance Test (OGTT) og Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Digital PCR for kvantificering af cirkulerende MicroRNA i akut myokardieinfarkt og hjerte-kar-sygdom

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...