Name: high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

נתמך על ידי מענקי NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​הארטוול הקרן, וקרן הצדקה של דוריס הדיוק. ד&quot;ר Paczesny הוא חוקר של אריק הארטוול הקרן ותכנית מחקר Manasevit Strelzer איימי.

1. יום הניסוי 0: לדוגמא הכנה וציפוי פלייט מבחן ELISA עם נוגדן ללכידת IL-2Rα, REG3α וHGF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות aliquot פלזמה כדי להיות מנותח תהיינה משכה מופשרים, והסתובב במהירות 12,000 סיבובים לדקה למשך 10 דקות כדי להפריד את הקרישים בתחתית והשומנים על גבי מהפלזמה. 150 μl של פלזמה לא מדוללת יהיה מצופה מכל דגימה לצלחת גם 96-V-תחתונה (צלחת מקור) על ידי pipetting הידני על פי מפות מוגדרות מראש. את aliquots יהיה עטוף בparafilm ושמר בתא לח ב 4 מעלות צלזיוס במשך כל התהליך; לא יותר מ 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוגדנים ללכוד HGF IL-2Rα ויהיה מחדש ודילול לפי מפרט יצרן ו 50 μl יהיו מצופה בכל באר של צלחות 96-כן גבוה מחייב בהתאמה גם חצי אז שנאטמו ודגרו הלילה ב 4 ° C. לחלופין, צלחות רבות ניתן לייבש על 37 מעלות צלזיוס ומאוחסנות ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר, תלויing על יציבותו של החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן ללכוד REG3α ידולל על פי פרוטוקול יצרן באמצעות חיץ ציפוי יצרן ו25 μl יהיה מצופה בכל אחד גם מצלחת 384 גם Nunc מקסי Sorp אשר לאחר מכן נאטם ודגר הלילה ב 4 ° C. </li></ol> 2. יום ניסוי 1: IL-2Rα ELISA (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מבחן IL-2Rα היא שטפה, נחסמה במשתגע בכפות, וההתקן מחדש ועקומת סטנדרט 8-נקודה מוכנה לפרוטוקול יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת הצלחת בעקבות צעד החסימה, 50 μl של פלזמה חייה הוא מצופה בשני עותקים מצלחת המקור לצלחת מבחן ELISA, ו 50 μl של כל התקן מצופה בשני עותקים. הצלחת היא חתומה ודגרה על 2 שעות בטמפרטורת חדר במסובב צלחת להגדיר ב 300 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלזמה היא קולחת מצלחת מבחן ELISA IL-2Rα והניחה חזרה באו&quot;םדילול צלחת מקור פלזמה. ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה ל450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 3. יום ניסוי 1: REG3α ELISA (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl של פלזמה חייה יועבר לצלחת מקור נפרדת V-תחתונה. 90 μl של חיץ דילול יצרן בתנאי שמתווסף לכל גם ליצור צלחת מקור דילול 1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> REG3α ELISA מתבצעת לפי פרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות 384 גם) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-620 ננומטר, והנתונים יישמרו ונותחו. </li></ol> 4. יום הניסוי 1: Elafin וציפוי פלייט מבחן TNFR1 עם נוגדן לכיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים ללכוד TNFR1 Elafin ויהיו משוחזרים ודילuted לפי מפרט יצרן ו 50 μl יהיה מצופה בכל באר של צלחות 96-כן גבוה מחייב בהתאמה גם חצי אז שנאטמו וטופחו במשך הלילה בטמפרטורת חדר למשך Elafin, ועל 4 מעלות צלזיוס במשך TNFR1. </li></ol> 5. ניסוי יום 1-2: HGF ELISA (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שסיימתי את IL-2Rα ELISA ומבטיח בדיקה לא יהיה צורך לחזור, 60 μl של פלזמה לא מדוללת יהיה מועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 60 μl של BSA 1% בx PBS 1 נוסף לכל גם לעשות צלחת 1:02 מדוללת פלזמת מקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מבחן HGF היא שטפה, נחסמה במשתגע בכפות, וההתקן מחדש ועקומת סטנדרט 8-נקודה מוכנה לפרוטוקול יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת הצלחת בעקבות צעד החסימה, 50 μl של פלזמה מדוללת 01:02 הוא מצופה בשני עותקים על צלחת מבחן ELISA, ו 50 μl של כל התקן מצופה בשני עותקים. הצלחת היא חתומה ודגר לילה בטמפרטורת חדר במסובב צלחת להגדיר ב 300 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלזמה המדוללת 1:02 היא קולח מצלחת מבחן ELISA HGF והניחה חזרה בצלחת מקור הפלזמה המדוללת 1:2. ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה ל450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 6. יום הניסוי 2: Elafin ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl של פלזמה חייה יועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 190 μl של BSA 1% בx PBS 1 יתווסף לכל אחד גם לעשות 200 μl של 1:20 dluted פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elafin ELISA כפי שמתבצע על פי פרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן), והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 7. הניסוי דאy 2: TNFR1 ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μl של BSA 1% בPBS יתווסף לצלחת המקור 01:20 (כרגע מכיל 100 μl של 1:20 פלזמה) כדי לקבל 125 μl של פלזמה מדוללת 1:25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TNFR1 ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 8. יום הניסוי 2: IL-8 ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 μl של פלזמה מדוללת 01:02 יהיה מועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 180 μl של IL-8 diluent נוסף לכל גם להפוך את צלחת מקור פלזמה מדוללת 01:06. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-8 ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> ברגע שכל ELISAs כבר הושלם, unuseד מניית פלזמה תוחלף לaliquots הפשיר והוקפאה לשימוש עתידי.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> שיטת ELISA הרציפה מוצגת כאן מאפשרת מדידה של חלבוני פלזמה מרובות בנפחים קטנים של פלזמה שעשויה להיות קשה להשגה ו / או תחליף כגון דגימות מבני אדם עם מחל נדירות או דגימות פלזמה שהתקבלו בעכברי 9,10. את ELISAs הרציף מבוצעים בדרך כלל בצו של גורם דילול פלזמה גוברת, עם ELISAs דורש פלזמה מדוללת ≥ 1:10 בדרך כלל לא זקוק לשם תיקח, למרות שזה יכול להיעשות אם רוצה. היכולת לבצע ELISA סדרתית מוגבלת על ידי ערכות ELISA / פרוטוקולים שבפלזמה היא מעורבת עם חומרים כימיים אחרים או למאגרי שדילול שונים נדרשות לפלזמה, זה מונע ablility לדגימה מחדש להשתמש בשל חששות שאינם תואמים חיץ / מגיב יפריע לביצועים של בדיקה מסוימת. עם תכנון קפדני, 10 או יותר ELISAs יכול להיות מבוצע באותה דגימת פלזמה. ent &quot;&gt; מעבדות בודדות הנדרשות להסתגל דילולי פלזמה על מנת שתהיינה תוצאות לפירוש המבוססות על ריכוזי פלזמה צפויות של החלבון של עניין בדגימות מהנבדקים. הבדלים בציוד מעבדה עלולה לגרום לצורך לייעל את הדגירה והתפתחות colorimetric פעמים, מספר הכביסות ו / או לשטוף לספוג פעמים על מנת לייעל את כל ELISA נתון. כדי להגדיל את כושר תפוקה גבוהה ודיוק ולבצע ניתוחים באופן יעיל וחסכוני, השימוש בפלטפורמה רובוטית טיפול נוזל מסוגלת לבצע ניתוחים על 384 גם צלחות ומכונת כביסת צלחת אוטומטית עם יחידה לערום מומלץ. ציוד זה יכול להגביר את הדיוק והדיוק של ניתוח שבוצע על ידי משתמשים מרובים, ויעזור לספק עקביות של ניתוח כדי להפחית ובין שונות התוך assay. אנחנו השתמשנו ELISA הרציף על גבי פלטפורמות זמינות זמנית משתי סיבות: 1) רובזוגות נוגדנים לחלבונים חדשים לא יכולים בקלות להיות מצומדת בחרוזים או חומר אחר, כמו גם זמן רב ויקרים: 2) מבחני ELISA בודדים הם מדויקים יותר מאשר microarray זמנית או חרוזים, משני להעדר תגובה צולבת 11. אם שיטה אמינה הוא הוקם כדי לבצע microarrays multiplexed, חרוז מבוסס, זה עשוי להיות מסוגל להחליף את תהליך ELISA הרציף, אך הוא עשוי להיות מוגבל על ידי היכולת להטות את הנוגדנים לחרוזים ו / או במספר החלבונים הרצויים להיות מנותח.

מחלה אקוטית שתל נגד מארח (GVHD), גורם מוביל לתמותה שאינה הישנות (NRM) לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT), נמדדת על ידי חוסר תפקוד בשלוש מערכות איברים: העור, בכבד ובמערכת עיכול (GI) מערכה 4. GVHD האקוטי מתרחש בדרך כלל בין שניים לשמונה שבועות לאחר השתלה, אך עלול להתרחש מאוחר יותר, ולעתים קרובות הוא קליני נבדל מסיבוכים שלאחר HSCT אחרים כגון רעילות מיזוג משטר, זיהום או תופעות לוואי של תרופות. באמצעות השימוש באסטרטגיות proteomic ואימות תפוקה גבוהה באמצעות ELISA הרציף, זיהו 6 חלבונים שריכוזים הם גבוהים בתחילת ביטויים קליניים של GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF ו IL-8, כאשר הוא משולב לתוך לוח 4-סמן ביולוגי יכול לאבחן GVHD בהופעת תסמינים קליניים ויכול לחזות הישרדות לאחר HSCT עצמאי של חומרת GVHD 1. Elafin, סמן ביולוגי לGVHD של skב, יכול להפלות בין הפריחה והפריחה GVHD מגורמים אחרים כגון התפרצויות סמים ויכול לחזות הישרדות השתלה 2. אנו זיהינו לאחרונה REG3α כמו סמן של GVHD של מערכת העיכול התחתונה, איבר המטרה הכי קשור NRM. ריכוז REG3α פלזמה אמין ניתן לזהות GVHD כסיבה לשלשולים לאחר HSCT ולתאם את החומרה היסטולוגית של GVHD בביופסיות מעי אבחון. ריכוזי REG3α בתחילת GVHD עיכול יכולים גם לחזות את ההיענות לטיפול וGVHD NRM 3. שילוב של הסמנים ביולוגיים GVHD האלה תקפים לטיפול קליני כעת נחקר בניסויים קליניים. ניסויים אלה בוצעו על aliquots פלזמה הקטנה שנאסף מהחולים שקבלו HSCT בין שנתי 2000 ו 2010 בזמן הופעת GVHD שהם חסרי תחליף וכמות מוגבלת. בשל האופי היקר של דגימות אלה, פתחו נפגשהוד של מדידת ריכוזי חלבוני פלזמה מרובים בצורה יעילה, לשעתק לחסל מחזורים עודפים הקפאת הפשרה, בזמן הפשרה ושימוש בפלזמה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים. כתב יד זה מתמקד בהיבטים הטכנולוגיים של מדידת סמנים ביולוגיים GVHD.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אדם IL-2 R אלפא Duoset </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> האדם HGF Duoset </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> IL-8 אדם OptEIA KIT השני </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-התאמת ההרכבה האנושית PAP1 (REG3α) ערכה </td><td> MBL הבינלאומי </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-התאמת UNIVERSAL קיט </td><td> MBL הבינלאומי </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> אדם sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> אדם Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> מו&quot;פ סאיםנובע </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-גם צלחות תחתונות חרוטי קלקר </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> משמש לצלחות מקור פלזמה </td></tr><tr><td> כוכב משנה חצי גם גבוהה מחייבות צלחות 96-כן </td><td> קורנינג </td><td> 3690 </td><td> לIL-2Rα, HGF, TNFR1 וelafin ELISAs </td></tr><tr><td> Nunc צלחות MaxiSorp 384 גם </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> לREG3α אליסה </td></tr><tr><td> HyClone נאגר מלוח פוספט, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין, Fraction V, הלם טיפול בחום </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> החוסם משתגע בTBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> סוכן חסימה לIL-2Rα HGF וTNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> Dulbecco שלפוספט נאגר מלוח </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> לשטוף חיץ לIL-2Rα, HGF, Elafin וTNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> Susbtrate החמצן TMB </td><td> Kirkegaard ומעבדות פרי </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> 20 Tween </td><td> אורגניקס acros </td><td> 233362500 </td><td> לשטוף חיץ לIL-2Rα, HGF, Elafin וTNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 84720 </td><td> (דילול ל2N) ללהפסיק פתרון </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

אסטרטגיות proteomics גילוי משוחדות יש פוטנציאל לזהות מספר גדול של סמנים ביולוגיים חדשניים שיכול לשפר את בדיקות אבחון ופרוגנוזה בסביבה קלינית ועשויים לעזור התערבויות מדריך טיפוליות. כאשר מספר גדול של חלבוני מועמד מזוהה, זה עלול להיות קשה כדי לאמת סמנים ביולוגיים מועמדים באופנה בזמן ויעיל מדגימות מטופל פלזמה המונעות אירוע, נפח סופי ואין לו תחליף, כגון בתחילה חריף שתל נגד מחל מארח (GVHD), סיבוך מסכן חיים של השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT). כאן אנו מתארים תהליך של ביצוע ELISAs הזמין מסחרי במשך שישה חלבונים GVHD תקף: IL-2Rα 5, TNFR1 6, 7 HGF, IL-8 8, elafin 2, וREG3α 3 (הידוע גם בPAP1), באופן רציף כדי למזער מחזורי הקפאת הפשרה, מופשר זמן פלזמה ושימוש בפלזמה. לביצוע הליך זה אנו מבצעים את ELISAs בסדר רציף, כפי שנקבעו על ידי גורם דילול מדגם כפי שנקבע במעבדה שלנו באמצעות ערכות ופרוטוקולי יצרן ELISA עם התאמות קלות כדי להקל על ביצועי ELISA רציפים אופטימליים. ריכוזי פלזמת הסמן הביולוגיים הנובעים אז ניתן להדר ונותחו לממצאים משמעותיים בתוך קבוצת מטופל. בעוד סמנים אלה הם כיום למטרות מחקר בלבד, שילובם בטיפול קליני כרגע נחקר בניסויים קליניים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים.

<html> עבודת הסמנים הביולוגיות וציר הזמן מפורטת בטבלת 1 וטבלה 2, בהתאמה. לאחר השלים, ריכוזים של 6 חלבונים שונים יש כעת לכמת באותו מדגם הפלזמה באמצעות סך של 150 μL של פלזמה. ציפוי הדגימות בכפילות למבחן מאפשר להבטחת איכות הפנימית, עם פחות מ 10% של קורות החיים למצב אופטימליים. אם ביצוע ELISA הרציף על צלחות מרובות, צפיפות אופטית עקבית של הרמה הגבוהה והם העדיפו לאפשר לאמינות משופרת בין צלחת של מדידות, עקומת מכנסי הש&quot;כ סטנדרטיים ניתן להשוות בין הצלחות להסתכל להעריך לחוסר עקביות בביצועי ELISA (איור 2). זמני פיתוח באמצעות מצע colorimetric tetramethylbenzidine וריכוז מכנסי הש&quot;כ גבוהים נצפו עבור כל סמן ביולוגי במעבדה שלנו מופיעים בלוח 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; איור 1 &quot;/&gt; איור 1. זרימת עבודה לIL-2Rα, REG3α וHGF ELISAs. לאחר שדגימות הפלזמה היו מצופית על צלחות בדיקת ELISA IL-2Rα הוא קולח לעשות צלחות מקור לדילול ELISAs אחר. לHGF ELISA, הפלזמה היא קולח להכין צלחת הדילול 01:06 לIL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. צפיפות אופטית לעקומה הסטנדרטית של 7 צלחות שונות ELISA מדידת ריכוזים מתאימים ל1084 החולים שנבדקו לדו&quot;ח הראשוני REG3α GI GVHD סמן 3 REG3α. מכנסי הש&quot;כ עקביים בין הצלחות להבטיח מדידות ריכוז חלבון עקביות בין צלחות. ריכוזים של חלבוניםבפלזמת דגימות מחושבות על ידי השוואה לדוגמה צפיפויות אופטיות לצפיפות האופטית עקומת הסטנדרט. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יום הניסוי 0 </td><td> 1. הכן את הדגימות </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF וREG3α הלכידה Ab </td></tr><tr><td> יום ניסוי 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (באמצעות ציפוי מדגם) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin וTNFR הלכידה Ab </td></tr><tr><td> יום הניסוי 2 </td><td> 1. השלמת HGF ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Refreeze שאינו בשימושפלזמה </td></tr></tbody></table> טבלת 1. סקירת זרימת סמנים ביולוגי GVHD <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> יום 0 </td><td colspan="3"> הכנת דוגמאות ודגירת גוף לכידת הלילה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> זמן (שעות) </td><td> 0.0 </td><td> חסימה </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td> דגימות המצופות </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td> טיב דגימות פלזמה; האיתור Ab </td><td> דוגמאות כן (1:10 דילול); חסימה </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> דגימות מצופות (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> האיתור Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> קריאת פלייט </td><td> TMB </td><td> דגימות כן (1:2 דילול); חסימה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td> קריאת פלייט </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> דגימות מצופות (1:2) </td><td> צלם Ab (דגירת הלילה) </td><td> צלם Ab (דגירת הלילה) </td><td></td></tr><tr><td> יום 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> זמן (שעות) </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td> טיב פלזמה, האיתור Ab </td><td> דגימות כן (1:20); חסימה </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> ציפוי לדוגמה (1:2) </td><td> חסימה; דילול נוסף של 1:20 דגימות לדילול 1:25 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> ציפוי לדוגמה (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td><td> האיתור Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> הכן דגימות (01:06 דילול) </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> האיתור Ab </td><td> ציפוי לדוגמה (1:06) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td&gt; <td> HRP </td><td> האיתור Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td></tr><tr><td colspan="2"> לאחר השלים </td><td colspan="6"> החלף פלזמת מקור לaliquots ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר </td></tr></tbody></table> טבלת 2. ציר זמן לביצוע ELISAs. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> גורם דילול פלזמה </td><td> ריכוז גבוה סטנדרטי </td><td> זמן פיתוח תשתית (דקות) </td><td> הגבוה OD </td><td> עקומה </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> קווים </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td> קווים </td></tr></tbody></table> לוח 3. פרטי ELISA ל6 סמני GVHD.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

אימות תפוקה גבוהה של סמנים ביולוגיים מועמדים מרובים יכולה להתבצע על ידי ELISA הרציף במטרה למזער מחזורי הקפאה / פשרה ושימוש בדגימות פלזמה יקרות. הנה, אנחנו מדגימים איך לבצע רצף ELISAs במשך שישה סמני פלזמת תוקף שונים<sup&gt; 1-3</sup&gt; למחלת שתל נגד מארח (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; באותו מדגם הפלזמה.

תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...