Name: high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00
Duration: 9 min
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NIH RC1 HL-101,102 अनुदान, P01 CA039542, T32 HL007622, ​​Hartwell फाउंडेशन, और डोरिस ड्यूक चैरिटटेबल फाउंडेशन द्वारा समर्थित है. डॉ. Paczesny एरिक Hartwell निधि और एमी Strelzer Manasevit अनुसंधान कार्यक्रम के एक अन्वेषक है.

1. प्रयोग 0 दिन: नमूना तैयार करने और आईएल 2Rα, REG3α और HGF के लिए एलिसा टेस्ट प्लेट कोटिंग कब्जा एंटीबॉडी के साथ <ol><li> प्लाज्मा अशेष भाजक विश्लेषण किया जा नमूनों, निकाला जाएगा thawed और 10 मिनट के लिए 12,000 rpm पर काता नीचे और प्लाज्मा से lipids शीर्ष पर थक्के को अलग. Undiluted प्लाज्मा के 150 μl प्रत्येक नमूने से एक 96 अच्छी तरह से थाली वि नीचे पर चढ़ाया जाएगा (स्रोत थाली) मैनुअल pipetting द्वारा पूर्वनिर्धारित नक्शे के अनुसार. aliquots parafilm में लपेटा जाएगा और पूरी प्रक्रिया के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नम चैम्बर में रखा है, अब और नहीं से 72 घंटा. </li><li> आईएल 2Rα और HGF कब्जा एंटीबॉडी और पुनर्गठन किया जाएगा निर्माता विनिर्देश और 50 μl प्रति पतला संबंधित उच्च बाध्यकारी 96-अच्छी तरह से आधा अच्छी तरह प्लेटें जो और फिर सील कर रहे हैं और 4 में रातोंरात incubated प्रत्येक अच्छी तरह ° सी. में चढ़ाया जाएगा वैकल्पिक रूप से, कई प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस पर सूख जा सकता है और 4 में संग्रहीत ° C बाद में उपयोग के लिए निर्भर है,प्रोटीन की स्थिरता पर रही है. </li><li> निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर निर्माता कोटिंग बफर और 25 μl REG3α पर कब्जा एंटीबॉडी अनुसार पतला जाएगा एक 384 अच्छी तरह Nunc मैक्सी Sorp प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह ° जो तब और सील 4 में रातोंरात incubated सी. में चढ़ाया जाएगा </li></ol> 2. प्रयोग दिन 1: आईएल 2Rα एलिसा (1 चित्रा) <ol><li> परीक्षण आईएल 2Rα प्लेट धोया है, टीबीएस में शराब के नशे में चूर से अवरुद्ध है, और मानक का पुनर्गठन किया है और एक मानक 8 बिंदु वक्र निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जाता है. </li><li> अवरुद्ध कदम के बाद प्लेट धोने के बाद, undiluted प्लाज्मा के 50 μl स्रोत थाली से एलिसा परीक्षण प्लेट दो प्रतियों में चढ़ाया जाता है, और प्रत्येक मानक के 50 μl दो प्रतियों में चढ़ाया जाता है. थाली सील और एक प्लेट 300 आरपीएम पर सेट रोटेटर पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए incubated. </li><li> प्लाज्मा आईएल 2Rα एलिसा परीक्षण प्लेट से reclaimed है और संयुक्त राष्ट्र में वापस रखाप्लाज्मा स्रोत थाली पतला. एलिसा निर्माता प्रोटोकॉल (आधा अच्छी तरह प्लेटें लिए समायोजित संस्करणों के साथ) और 450-570 एनएम के लिए एक प्लेट पाठक सेट का उपयोग कर पढ़ा जाएगा प्रत्येक अच्छी तरह से ऑप्टिकल घनत्व प्रति पूरा हो गया है, और डेटा को बचाया और विश्लेषण. </li></ol> 3. प्रयोग दिन 1: REG3α एलिसा (1 चित्रा) <ol><li> Undiluted प्लाज्मा के 10 μl एक अलग स्रोत v नीचे की थाली को हस्तांतरित किया जाएगा. निर्माता - प्रदान कमजोर पड़ने बफर के 90 μl प्रत्येक के लिए एक 1:10 कमजोर पड़ने स्रोत प्लेट बनाने के लिए अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा गया है. </li><li> REG3α एलिसा निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है (मात्रा के साथ 384 अच्छी तरह प्लेटें के लिए समायोजित) और प्रत्येक अच्छी तरह के ऑप्टिकल घनत्व 450-620 एनएम सेट एक प्लेट रीडर का उपयोग कर पढ़ा जाएगा, और डेटा और बच जाएगा विश्लेषण. </li></ol> 4. प्रयोग दिन 1: Elafin और कब्जा एंटीबॉडी के साथ TNFR1 टेस्ट प्लेट कोटिंग <ol><li> Elafin और TNFR1 कब्जा एंटीबॉडी पुनर्गठन और दिल हो जाएगानिर्माता विनिर्देश और 50 μl प्रति uted संबंधित उच्च बाध्यकारी 96-अच्छी तरह से आधा अच्छी तरह प्लेटें जो और फिर सील कर रहे हैं और कमरे के तापमान पर रातोंरात Elafin लिए incubated प्रत्येक कुएं में चढ़ाया जाएगा, और 4 डिग्री सेल्सियस TNFR1 के लिए. </li></ol> 5. प्रयोग दिन 1-2: HGF एलिसा (1 चित्रा) <ol><li> IL-2Rα एलिसा को पूरा करने और आश्वस्त परीक्षण के बाद दोहराया जा जरूरत नहीं है, undiluted प्लाज्मा के 60 μl एक नए स्रोत की थाली के लिए हस्तांतरित और फिर 1 x पीबीएस में 1% BSA की 60 μl एक अच्छी तरह से करने के लिए एक जोड़ा जाता है 01:02 पतला प्लाज्मा स्रोत थाली. </li><li> धोया HGF परीक्षण प्लेट है, टीबीएस में शराब के नशे में चूर से अवरुद्ध है, और मानक का पुनर्गठन किया है और एक मानक 8 बिंदु वक्र निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जाता है. </li><li> अवरुद्ध कदम के बाद प्लेट धोने के बाद, 01:02 पतला प्लाज्मा के 50 μl एलिसा परीक्षण प्लेट पर डुप्लिकेट में चढ़ाया जाता है, और प्रत्येक मानक के 50 μl दो प्रतियों में चढ़ाया जाता है. प्लेट और सीलकमरे के तापमान पर रातोंरात एक प्लेट 300 आरपीएम पर सेट रोटेटर पर incubated. </li><li> 01:02 पतला प्लाज्मा HGF एलिसा परीक्षण थाली से reclaimed है और 1:02 पतला प्लाज्मा स्रोत थाली में वापस रखा. एलिसा निर्माता प्रोटोकॉल (आधा अच्छी तरह प्लेटें लिए समायोजित संस्करणों के साथ) और 450-570 एनएम के लिए एक प्लेट पाठक सेट का उपयोग कर पढ़ा जाएगा प्रत्येक अच्छी तरह से ऑप्टिकल घनत्व प्रति पूरा हो गया है, और डेटा को बचाया और विश्लेषण. </li></ol> 6. प्रयोग 2 दिन: Elafin एलिसा <ol><li> Undiluted प्लाज्मा के 10 μl एक नए स्रोत की थाली को हस्तांतरित किया जाएगा और फिर 1 x पीबीएस में 1% BSA के 190 μl एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ दिया जाएगा 200 μl का प्लाज्मा dluted 1:20. </li><li> एलिसा Elafin निर्माता प्रोटोकॉल (संस्करणों के साथ आधा अच्छी तरह से प्लेटों के लिए समायोजित), और प्रत्येक अच्छी तरह के ऑप्टिकल घनत्व के अनुसार प्रदर्शन एक थाली 450-570 एनएम सेट रीडर का उपयोग कर पढ़ा जाएगा, और डेटा को बचाया और विश्लेषण. </li></ol> 7. प्रयोग दा2 y: TNFR1 एलिसा <ol><li> पीबीएस में 1% BSA की 25 μl 1:20 स्रोत प्लेट (अब 1:20 प्लाज्मा के 100 μl युक्त) 1:25 पतला प्लाज्मा के 125 μl प्राप्त करने के लिए जोड़ दिया जाएगा. </li><li> निर्माता प्रोटोकॉल प्रति TNFR1 एलिसा पूरा हो गया है (आधा अच्छी तरह प्लेटें लिए समायोजित संस्करणों के साथ) और एक प्लेट पाठक 450-570 एनएम सेट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह के ऑप्टिकल घनत्व पढ़ा जाएगा, और डेटा को बचाया और विश्लेषण. </li></ol> 8. प्रयोग 2 दिन: IL-8 एलिसा <ol><li> 01:02 पतला प्लाज्मा के 60 μl एक नए स्रोत की थाली को हस्तांतरित और फिर IL-8 तनुकारक (वस्तु) के 180 μl एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा है 01:06 पतला प्लाज्मा स्रोत थाली. </li><li> आईएल 8 एलिसा निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पूरा हो गया है (आधा अच्छी तरह प्लेटें लिए समायोजित संस्करणों के साथ) और एक प्लेट पाठक 450-570 एनएम सेट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह के ऑप्टिकल घनत्व पढ़ा जाएगा, और डेटा को बचाया और विश्लेषण. </li></ol> एक बार सभी ELISAs unuse पूरा किया गया है,घ स्टॉक प्लाज्मा thawed aliquots में बदल दिया जाएगा और भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए.

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	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

<html> अनुक्रमिक एलिसा विधि यहाँ प्रस्तुत एकाधिक प्लाज्मा प्रोटीन की प्लाज्मा के छोटे मात्रा में जो प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है और / या 9,10 चूहों से प्राप्त दुर्लभ रोगों या प्लाज्मा नमूनों के साथ मानव विषयों से नमूने के रूप में अपूरणीय पर माप के लिए अनुमति देता है. अनुक्रमिक ELISAs प्लाज्मा कमजोर पड़ने कारक बढ़ाने के क्रम में आम तौर पर प्रदर्शन कर रहे हैं, के साथ की आवश्यकता होती है ELISAs प्लाज्मा पतला ≥ 1:10 आम तौर पर की आवश्यकता होगी, reclaimed, हालांकि यह किया जा सकता है अगर वांछित नहीं है. अनुक्रमिक एलिसा प्रदर्शन करने की क्षमता एलिसा किट / प्रोटोकॉल जिसमें प्लाज्मा अन्य अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है या जिसके लिए अलग कमजोर पड़ने buffers प्लाज्मा के लिए आवश्यक हैं द्वारा सीमित है, यह एक नमूना फिर से उपयोग के कारण चिंता है कि एक असंगत ablility precludes बफर / अभिकर्मक एक विशेष परीक्षण के प्रदर्शन के साथ हस्तक्षेप करेगा. सावधान योजना के साथ, 10 या अधिक ELISAs ही प्लाज्मा नमूना पर किया जा सकता है. ent &quot;&gt; व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं प्लाज्मा dilutions समायोजित क्रम में व्याख्या के परिणाम के आधार पर परीक्षण विषयों से नमूनों में ब्याज की प्रोटीन की उम्मीद प्लाज्मा सांद्रता प्रयोगशाला उपकरणों में अंतर की जरूरत हो सकता है की जरूरत में परिणाम ऊष्मायन और वर्णमिति विकास का अनुकूलन बार बार, washes की संख्या और / या धो लो सोख के क्रम में किसी भी एलिसा अनुकूलन. उच्च throughput क्षमता और सटीकता को बढ़ाने के लिए और एक लागत प्रभावी ढंग से विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, एक रोबोट तरल से निपटने 384 अच्छी तरह से प्लेटों पर विश्लेषण और stacking यूनिट के साथ एक स्वचालित प्लेट वॉशर सक्षम मंच के उपयोग की सिफारिश कर रहे हैं. इस उपकरण सटीकता और विश्लेषण की परिशुद्धता एकाधिक उपयोगकर्ताओं द्वारा प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए कर सकते हैं, और विश्लेषण के स्थिरता प्रदान करने के लिए अंतर और अंतर परख भिन्नता को कम करने में मदद. 1) के अधिकांश: हम दो कारणों के लिए उपलब्ध मल्टीप्लेक्स प्लेटफार्मों पर इस्तेमाल अनुक्रमिक एलिसाउपन्यास प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी जोड़े आसानी से मोती या अन्य सामग्री पर संयुग्मित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय लेने और महंगी नहीं हो सकता है, 2) व्यक्तिगत एलिसा assays मल्टीप्लेक्स माइक्रोएरे या मोती, 11 पार जेट की अनुपस्थिति के लिए माध्यमिक की तुलना में अधिक सटीक हैं. यदि एक विश्वसनीय विधि मल्टिप्लेक्स, मनका आधारित प्रोटीन प्रदर्शन करने के लिए स्थापित किया गया है, यह अनुक्रमिक एलिसा प्रक्रिया की जगह करने में सक्षम हो सकता है, लेकिन हो सकता है माला और / एंटीबॉडी संयुग्म की क्षमता या हो वांछित प्रोटीन की संख्या से सीमित किया जा सकता है विश्लेषण किया.

तीव्र भ्रष्टाचार बनाम मेजबान (GVHD) रोग, allogeneic hematopoietic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT) के बाद मृत्यु गैर पलटा (एनआरएम) का एक प्रमुख कारण है, तीन अंग प्रणालियों में शिथिलता से मापा जाता है: त्वचा, यकृत, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (GI) 4 पथ. तीव्र GVHD प्रत्यारोपण के बाद दो और आठ के बीच सप्ताह आम तौर पर होता है लेकिन बाद में हो सकता है, और अक्सर चिकित्सकीय कंडीशनिंग regimen विषाक्तता, संक्रमण या दवा के साइड इफेक्ट के रूप में अन्य के बाद HSCT जटिलताओं से अप्रभेद्य है. प्रोटिओमिक रणनीतियों और उच्च throughput मान्यता अनुक्रमिक एलिसा का उपयोग कर के उपयोग के माध्यम से, हम 6 प्रोटीन सांद्रता जिसका GVHD के नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ की शुरुआत में ऊंचा कर रहे हैं की पहचान की है. आईएल 2Rα, TNFR1, HGF और IL-8, जब एक 4-biomarker पैनल में संयुक्त नैदानिक ​​लक्षणों की शुरुआत में GVHD का निदान कर सकते हैं और के बाद HSCT अस्तित्व GVHD 1 गंभीरता की स्वतंत्र रूप से भविष्यवाणी कर सकते हैं. Elafin, एस के GVHD के लिए एक biomarker, GVHD दाने और दाने के बीच दवा eruptions के रूप में अन्य कारणों से भेदभाव और प्रत्यारोपण 2 अस्तित्व की भविष्यवाणी कर सकते हैं कर सकते हैं. हमने हाल ही में कम जठरांत्र पथ के GVHD के एक biomarker के रूप REG3α की पहचान की है, लक्ष्य अंग सबसे एनआरएम के साथ जुड़े है. प्लाज्मा REG3α एकाग्रता मज़बूती के बाद HSCT दस्त के लिए कारण के रूप में GvHD की पहचान कर सकते हैं और नैदानिक ​​आंतों बायोप्सी पर GVHD के histologic गंभीरता सहसंबंधी. सैनिक GVHD शुरुआत में REG3α सांद्रता भी GVHD चिकित्सा और NRM 3 के लिए जवाबदेही की भविष्यवाणी कर सकते हैं. चिकित्सीय देखभाल में इन मान्य GVHD बायोमार्कर के समावेश वर्तमान में नैदानिक ​​परीक्षणों में जांच की जा रही है. इन प्रयोगों छोटे प्लाज्मा GVHD शुरुआत का समय है कि अपूरणीय हैं और सीमित मात्रा के 2000 और 2010 के बीच HSCT प्राप्त रोगियों से एकत्र aliquots पर प्रदर्शन किया गया. इन नमूनों का कीमती प्रकृति के कारण, हम एक मुलाकात विकसित किया हैएक कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अतिरिक्त फ्रीज पिघलना चक्र, पिघलना समय और प्लाज्मा के उपयोग को समाप्त करने के तरीके में कई प्लाज्मा प्रोटीन सांद्रता को मापने के ख़्वांचा. इस तकनीक के लिए एक ही नमूना पर कई प्रोटीन / ब्याज की साइटोकिन्स ELISAs करने के लिए लागू किया जा सकता है (ओं) के नमूनों प्रदान करने की जरूरत है अन्य अभिकर्मकों के साथ मिलाया जा नहीं. यदि एलिसा किट पूर्व लेपित प्लेटें, 96-अच्छी तरह से आधा अच्छी तरह प्लेटें या 384 अच्छी तरह प्लेटें के साथ नहीं आते हैं आगे नमूने / अभिकर्मकों के उपयोग को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पांडुलिपि GVHD biomarkers को मापने के तकनीकी पहलुओं पर केंद्रित है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> मानव IL-2 आर अल्फा Duoset </td><td> आर एंड डी सिस्टम </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> मानव HGF Duoset </td><td> आर एंड डी सिस्टम </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> मानव आईएल 8 OptEIA किट द्वितीय </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> अब मैच विधानसभा मानव (REG3α) PAP1 किट </td><td> MBL इंटरनेशनल </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> अब मैच यूनिवर्सल किट </td><td> MBL इंटरनेशनल </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> मानव sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> आर एंड डी सिस्टम </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> मानव Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> आर एंड डी Syउपजी </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-polystyrene शंक्वाकार नीचे प्लेटों </td><td> थर्मो वैज्ञानिक </td><td> 249570 </td><td> प्लाज्मा स्रोत प्लेटों के लिए प्रयुक्त </td></tr><tr><td> Costar आधा अच्छी तरह से उच्च बाध्यकारी 96 अच्छी तरह प्लेटें </td><td> कोर्निंग </td><td> 3690 </td><td> आईएल 2Rα HGF, TNFR1 और elafin ELISAs के लिए </td></tr><tr><td> Nunc 384 अच्छी तरह MaxiSorp प्लेटें </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> REG3α एलिसा के लिए </td></tr><tr><td> HyClone फास्फेट buffered खारा 1x, </td><td> थर्मो वैज्ञानिक </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> गोजातीय सीरम albumin, अंश वी, गर्मी इलाज शॉक </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> टीबीएस में अवरोधक शराब के नशे में चूर </td><td> थर्मो वैज्ञानिक </td><td> 37530 </td><td> HGF आईएल 2Rα और TNFR1 ELISAs के लिए अवरुद्ध एजेंट </td></tr><tr><td> Dulbecco हैखारा फास्फेट Buffered </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> धोने के आईएल 2Rα HGF, Elafin और TNFR1 ELISAs के लिए बफर </td></tr><tr><td> TMB पेरोक्साइड Susbtrate </td><td> Kirkegaard और पेरी प्रयोगशालाओं </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> 20 Tween </td><td> Acros ऑर्गेनिक्स </td><td> 233362500 </td><td> धोने के आईएल 2Rα HGF, Elafin और TNFR1 ELISAs के लिए बफर </td></tr><tr><td> गंधक का तेजाब </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (2N को पतला) समाधान के लिए </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

निष्पक्ष खोज प्रोटिओमिक्स रणनीतियों उपन्यास biomarkers की बड़ी संख्या है कि एक नैदानिक ​​सेटिंग में निदान और शकुन परीक्षण में सुधार और उपचारात्मक उपायों गाइड मदद मिल सकती है की पहचान करने की क्षमता है. जब उम्मीदवार प्रोटीन की बड़ी संख्या की पहचान कर रहे हैं, यह मुश्किल हो करने के लिए एक समय और कुशल फैशन में रोगी प्लाज्मा नमूनों कि परिमित मात्रा की घटना संचालित है, और स्थिर हैं तीव्र की शुरुआत में इस तरह के रूप में, से उम्मीदवार biomarkers मान्य हो सकता है भ्रष्टाचार बनाम मेजबान (GVHD) रोग, allogeneic hematopoietic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT) के एक संभावित जीवन धमकी जटिलता. एक अनुक्रमिक फैशन में 5 आईएल 2Rα, TNFR1 6, 7 HGF आईएल-8, 8, 2 elafin, और REG3α 3 (भी PAP1 के रूप में जाना जाता है) को कम से कम करने के लिए: यहाँ हम छह मान्य GVHD प्रोटीन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ELISAs प्रदर्शन करने की प्रक्रिया का वर्णन फ्रीज पिघलना चक्रप्लाज्मा समय और प्लाज्मा के उपयोग thawed. इस प्रक्रिया के लिए हम अनुक्रमिक क्रम में ELISAs प्रदर्शन के रूप में मन्दन नमूना कारक द्वारा निर्धारित रूप में हमारी प्रयोगशाला में मामूली समायोजन के साथ निर्माता एलिसा किट और प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए इष्टतम अनुक्रमिक एलिसा प्रदर्शन की सुविधा स्थापित. जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मा biomarker सांद्रता तो संकलित किया जा सकता है और एक मरीज पलटन के भीतर महत्वपूर्ण निष्कर्ष के लिए विश्लेषण किया. जबकि इन biomarkers अनुसंधान प्रयोजनों के लिए ही कर रहे हैं, चिकित्सीय देखभाल में उनके शामिल वर्तमान में नैदानिक ​​परीक्षणों में जांच की जा रही है. इस तकनीक के लिए एक ही नमूना पर कई प्रोटीन / ब्याज की साइटोकिन्स ELISAs करने के लिए लागू किया जा सकता है (ओं) के नमूनों प्रदान करने की जरूरत है अन्य अभिकर्मकों के साथ मिलाया जा नहीं. यदि एलिसा किट पूर्व लेपित प्लेटें, 96-अच्छी तरह से आधा अच्छी तरह प्लेटें या 384 अच्छी तरह प्लेटें के साथ नहीं आते हैं आगे नमूने / अभिकर्मकों के उपयोग को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

<html> biomarker कार्यप्रवाह और समय तालिका 1 और 2 टेबल में विस्तृत कर रहे हैं, क्रमशः. एक बार जब पूरा, अब 6 अलग प्रोटीन की सांद्रता ही प्लाज्मा नमूना पर मात्रा निर्धारित किया गया है प्लाज्मा के 150 μL के एक कुल का उपयोग. परीक्षण प्रति डुप्लिकेट नमूने चढ़ाना CV कम से कम 10% इष्टतम के साथ की जा रही आंतरिक गुणवत्ता आश्वासन के लिए अनुमति देता है. यदि कई प्लेटें, उच्च मानक के अनुरूप ऑप्टिकल घनत्व पर अनुक्रमिक एलिसा प्रदर्शन पसंद कर रहे हैं और माप की विश्वसनीयता में सुधार के लिए अंतर - प्लेट के लिए अनुमति देने के मानक वक्र ods प्लेटों के बीच तुलना की जा सकती है (2 चित्रा) एलिसा प्रदर्शन में विसंगति मूल्यांकन करने के लिए देखने के. विकास tetramethylbenzidine वर्णमिति सब्सट्रेट और उच्च एकाग्रता ods का उपयोग बार हमारी प्रयोगशाला में प्रत्येक biomarker के लिए मनाया 3 तालिका में सूचीबद्ध हैं. &quot;alt =&quot; tp_upload/4247/4247fig1.jpg चित्रा 1 &quot;/&gt; चित्रा 1 आईएल 2Rα, REG3α और HGF ELISAs के लिए कार्यप्रवाह. प्लाज्मा नमूनों के बाद आईएल 2Rα एलिसा परीक्षण प्लेटों पर चढ़ाया है और यह अन्य ELISAs लिए कमजोर पड़ने स्रोत प्लेट बनाने के लिए reclaimed है. HGF एलिसा के लिए, प्लाज्मा IL-8 के लिए 1:06 कमजोर पड़ने प्लेट तैयार reclaimed है. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">बड़ा आंकड़ा के लिए यहां क्लिक करें</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="चित्रा 2"/> चित्रा 2 7 अलग एलिसा प्लेट REG3α प्रारंभिक REG3α सैनिक GVHD biomarker 3 रिपोर्ट के लिए 1084 का परीक्षण किया रोगियों को इसी सांद्रता को मापने का मानक वक्र के लिए ऑप्टिकल घनत्व. प्लेटों के बीच लगातार ods प्लेटों के बीच लगातार प्रोटीन एकाग्रता माप आश्वासन देता हूं. प्रोटीन की सांद्रताप्लाज्मा में नमूने मानक वक्र ऑप्टिकल घनत्व नमूना ऑप्टिकल घनत्व की तुलना द्वारा की गणना कर रहे हैं. <table border="1"><tbody><tr><td> प्रयोग 0 दिन </td><td> 1. नमूने तैयार </td></tr><tr><td></td><td> 2. आईएल 2Rα, HGF और REG3α पर कब्जा अटल बिहारी </td></tr><tr><td> प्रयोग दिन 1 </td><td> 1. आईएल 2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF एलिसा (नमूना चढ़ाना के माध्यम से) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin और TNFR पर कब्जा अटल बिहारी </td></tr><tr><td> प्रयोग 2 दिन </td><td> 1. HGF एलिसा पूरा होने </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin एलिसा </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 एलिसा </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 एलिसा </td></tr><tr><td></td><td> 5. अप्रयुक्त refreezeप्लाज्मा </td></tr></tbody></table> तालिका 1. GVHD Biomarker कार्यप्रवाह अवलोकन <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 0 दिन </td><td colspan="3"> नमूना तैयार करने और रातोंरात कब्जा शरीर ऊष्मायन </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> एलिसा </td><td> आईएल 2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> आईएल-8 </td></tr><tr><td> समय (घंटा) </td><td> 0.0 </td><td> ब्लॉकिंग </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td> मढ़वाया नमूने </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td> डिटेक्शन अटल बिहारी, प्लाज्मा नमूनों को पुनः प्राप्त </td><td> अवरुद्ध, तैयार नमूने (1:10 कमजोर पड़ने) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> मढ़वाया नमूने (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidin-एचआरपी </td><td> डिटेक्शन अब </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-एचआरपी </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> प्लेट पढ़ना </td><td> TMB </td><td> अवरुद्ध, तैयार नमूने (1:2 कमजोर पड़ने) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td> प्लेट पढ़ना </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> मढ़वाया नमूने (1:2) </td><td> अब (रातोंरात ऊष्मायन) पर कब्जा </td><td> अब (रातोंरात ऊष्मायन) पर कब्जा </td><td></td></tr><tr><td> 2 दिन </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> समय (घंटा) </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td> प्लाज्मा, जांच अब पुनः प्राप्त </td><td> अवरुद्ध, तैयार नमूने (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> नमूना चढ़ाना (1:2) </td><td> अवरुद्ध, 1:25 कमजोर पड़ने 1:20 नमूने के आगे कमजोर पड़ने </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> एचआरपी </td><td></td><td> नमूना चढ़ाना (01:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td> प्लेट पढ़ना </td><td> डिटेक्शन अब </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> नमूने (1:06 कमजोर पड़ने) तैयार </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> डिटेक्शन अब </td><td> नमूना चढ़ाना (01:06) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> एचआरपी </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> प्लेट पढ़ना </td&gt; <td> एचआरपी </td><td> डिटेक्शन अब </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> प्लेट पढ़ना </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> प्लेट पढ़ने </td></tr><tr><td colspan="2"> पूरा होने के बाद </td><td colspan="6"> Aliquots में स्रोत प्लाज्मा बदलें और फ्रीज के लिए बाद में उपयोग के </td></tr></tbody></table> तालिका 2 ELISAs प्रदर्शन के लिए समय रेखा. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> प्लाज्मा कमजोर पड़ने कारक </td><td> उच्च मानक एकाग्रता </td><td> सब्सट्रेट विकास समय (मिनट) </td><td> उच्च आयुध डिपो </td><td> वक्र </td></tr><tr><td> आईएल 2Rα </td><td> 1:01 </td><td> 2000 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> रैखिक </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 1:02 </td><td> 4000 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर </td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4 पैरामीटर </td></tr><tr><td> आईएल-8 </td><td> 1:06 </td><td> 200 स्नातकोत्तर / एमएल </td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4 पैरामीटर </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1:10 </td><td> 100 एनजी / एमएल </td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4 पैरामीटर </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1:20 </td><td> 2000 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर </td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4 पैरामीटर </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1:25 </td><td> 800 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर </td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td> रैखिक </td></tr></tbody></table> तालिका 3 6 GVHD बायोमार्कर के लिए एलिसा विवरण.

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High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

कई उम्मीदवार बायोमार्कर के उच्च throughput सत्यापन अनुक्रमिक एलिसा द्वारा किया जा सकता है क्रम में करने के लिए कम से कम स्थिर / गल चक्र और कीमती प्लाज्मा नमूनों के उपयोग के लिए. यहाँ, हम प्रदर्शन कैसे क्रमिक रूप से प्रदर्शन करने के लिए छह अलग मान्य प्लाज्मा बायोमार्कर के लिए ELISAs<sup&gt; 1-3</sup&gt; भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; एक ही प्लाज्मा नमूना पर.

गंभीर बीमारी भ्रष्टाचार बनाम मेजबान के बायोमार्कर के सत्यापन के लिए उच्च Throughput अनुक्रमिक एलिसा

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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