Name: high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

Med stöd av NIH bidrag RC1-HL-101.102, P01-CA039542, T32-HL007622 har Hartwell Foundation och Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny är en utredare för Eric Hartwell fonden och Amy Strelzer Manasevit forskningsprogram.

1. Experiment Dag 0: Provberedning och ELISA testplatta Beläggning med infångningsantikropp för IL-2Ra, REG3α och HGF <ol><li> Plasma Delmängder som skall analyseras kommer att dras, tinas och centrifugerades vid 12.000 rpm under 10 minuter för att separera koagel vid botten och lipider ovanpå från plasman. 150 il outspädd plasma skall pläteras från varje prov på en 96-brunnars V-botten platta (källplattan) genom manuell pipettering enligt fördefinierade kartor. Alikvoterna skall förpackas i parafilm och hölls i en fuktig kammare vid 4 ° C under hela processen, inte längre än 72 timmar. </li><li> IL-2Ra och HGF-antikroppar fånga kommer att beredas och spädas per tillverkare specifikation och 50 pl kommer utströks i varje brunn i respektive 96-brunnars hög-bindande halv-brunnsplattor vilka sedan förseglas och inkuberas över natten vid 4 ° C. Alternativt kan många plattor torkas vid 37 ° C och lagrades vid 4 ° C för senare användning, beroendeIng på stabiliteten hos proteinet. </li><li> REG3α infångningsantikropp kommer spädas enligt tillverkarens protokoll med användning av buffert tillverkare beläggning och 25 pl kommer att pläteras i varje brunn av en 384-väl Nunc Maxi-Sorp platta som sedan försluts och inkuberas över natten vid 4 ° C. </li></ol> 2. Experiment Dag 1: IL-2Ra-ELISA (figur 1) <ol><li> IL-2Ra testplatta tvättas, blockeras med BLOTTO i TBS, och standardavvikelsen bereds och en 8-punkt standardkurva beredd enligt tillverkarens protokoll. </li><li> Efter tvättning av plattan efter blockerande steget 50 il outspädd plasma utströks i duplikat från källplattan till ELISA-testplattan, och 50 | il av varje standard pläteras i duplikat. Plattan förseglas och inkuberas under 2 timmar vid rumstemperatur på en platta rotator inställd på 300 varv per minut. </li><li> Plasman återvinns från IL-2Ra ELISA-test plattan och placeras tillbaka i FNutspädd platta plasmakälla. ELISA avslutas per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en uppsättning plattläsare till 450-570 nm och data sparas och analyseras. </li></ol> 3. Experiment Dag 1: REG3α ELISA (figur 1) <ol><li> 10 il outspädd plasma kommer att överföras till en separat v-botten källplatta. 90 pl av tillverkarens tillhandahålls-spädningsbuffert tillsätts till varje brunn för att skapa en 1:10 spädning platta källa. </li><li> Den REG3α ELISA utförs per tillverkare protokoll (med volymer justerat för 384-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-620 nm och data sparas och analyseras. </li></ol> 4. Experiment Dag 1: Elafin och TNFR1 testplatta Beläggning med infångningsantikropp <ol><li> Elafin och TNFR1 antikroppar fånga blir rekonstituerad och utspädderas per tillverkare specifikation och 50 pl kommer utströks i varje brunn i respektive 96-brunnars hög-bindande halv-brunnsplattor vilka sedan förseglas och inkuberas över natten vid rumstemperatur under Elafin, och vid 4 ° C under TNFR1. </li></ol> 5. Experiment Dag 1-2: HGF-ELISA (figur 1) <ol><li> Efter avslutad IL-2Ra ELISA och säkerställa testet inte behöver upprepas, kommer 60 il outspädd plasma överfördes till en ny källa plattan och sedan 60 pl av 1% BSA i 1 x PBS sattes till varje brunn för att göra en utspädning 1:2 plasmakälla plattan. </li><li> HGF testplatta tvättas, blockeras med BLOTTO i TBS, och standardavvikelsen bereds och en 8-punkt standardkurva beredd enligt tillverkarens protokoll. </li><li> Efter tvättning av plattan efter blockerande steget 50 pl av 1:2 utspädd plasma pläteras i två exemplar på ELISA testplatta, och 50 | il av varje standard pläteras i duplikat. Plattan förseglas ochinkuberades över natten vid rumstemperatur på en platta rotator inställd på 300 rpm. </li><li> 1:2-utspädd plasma återvinns från HGF ELISA-testplattan och placeras tillbaka i utspädning 1:2 plasman källplatta. ELISA avslutas per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en uppsättning plattläsare till 450-570 nm och data sparas och analyseras. </li></ol> 6. Experiment Dag 2: Elafin ELISA <ol><li> 10 il outspädd plasma kommer att överföras till en ny källa plattan och sedan 190 | il av 1% BSA i 1 x PBS kommer att läggas till varje brunn för att göra 200 il plasma dluted 1:20. </li><li> Den Elafin ELISA utförs som enligt tillverkarens protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar), och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-570 nm och data sparas och analyseras. </li></ol> 7. Experiment Day 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 pl av 1% BSA i PBS kommer att läggas till 1:20 källplattan (nu innehållande 100 pl plasma 1:20) för att erhålla 125 il 1:25 utspädd plasma. </li><li> Den TNFR1 ELISA avslutas per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-570 nm och data sparas och analyseras. </li></ol> 8. Experiment Dag 2: IL-8-ELISA <ol><li> 60 pl av 1:2 utspädd plasma kommer att överföras till en ny källa plattan och sedan 180 pl av IL-8 spädningsmedel tillsätts till varje brunn för att göra en 01:06 utspädd platta plasmakälla. </li><li> IL-8-ELISA är klar per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-570 nm och data sparas och analyseras. </li></ol> När alla ELISA har slutförts, unused lager plasma kommer att ersättas i de upptinade alikvoter och frystes för framtida användning.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

<html> Den sekventiella ELISA-metod som presenteras här tillåter mätning av flera plasmaproteiner på små volymer plasma som kan vara svåra att få tag på och / eller oersättliga som prover från människor med sällsynta sjukdomar eller plasmaprov som erhållits från möss 9,10. De sekventiella ELISA vanligtvis utförs i den ordning av ökande plasma spädningsfaktor med ELISA kräver plasma utspädd ≥ 1:10 vanligtvis inte behöver återkrävas, även om detta kan göras om så önskas. Förmågan att utföra sekventiell ELISA begränsas av ELISA kit / protokoll där plasma blandas med andra reagens eller för vilka olika utspädning buffertar behövs för plasman, vilket utesluter ablility att återanvända ett prov på grund av oro för att en inkompatibel buffert / reagens stör utförandet av en viss test. Med noggrann planering kan 10 eller fler ELISA utföras på samma plasmaprov. ENT &quot;&gt; Individuella laboratorier kan behöva justera plasma utspädningar för att få tolkningsbara resultat baserade på förväntade plasmakoncentrationer av proteinet av intresse i proverna från försökspersonerna. Skillnader i laboratorieutrustning kan resultera i ett behov att optimera inkubation och kolorimetriska utveckling gånger, antalet tvättar och / eller tvätta blöta gånger för att optimera någon given ELISA. För att öka hög genomströmning kapacitet och noggrannhet och att utföra analyser på ett kostnadseffektivt sätt, är användningen av en robot vätskehanterande plattform som kan analys på 384 brunnar och en automatiserad plattvättare med staplingsenhet rekommenderas. Denna utrustning kan öka noggrannhet och precision av analys av flera användare, och bidra till att ge konsekvent analys för att minska inter-och intra-assay variation. Vi använde sekventiell ELISA över tillgängliga multiplex plattformar för två anledningar: 1) De flesta av deantikroppar par för nya proteiner kan inte lätt konjugeras på pärlor eller annat material samt tidskrävande och dyrt, 2) enskilda ELISA-analyser är mer precisa än multiplex microarray eller pärlor, sekundärt till en frånvaro av korsreaktivitet 11. Om en tillförlitlig metod etableras utföra multiplexerade, pärl-baserade mikromatriser, kan det vara kunna ersätta den sekventiella ELISA-processen, men kan begränsas av förmågan att konjugera antikropparna till pärlorna och / eller av antalet proteiner önskas vara analyseras.

Akut transplantat-mot-värd-sjukdom (GVHD), en ledande orsak till icke-återfall dödlighet (NRM) efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT), mäts genom dysfunktion i tre organsystem: huden, levern och gastrointestinala (GI) tarmkanalen 4. Akut GVHD uppstår vanligen mellan två och åtta veckor efter transplantation men kan förekomma senare och är ofta kliniskt skilja från andra efter HSCT komplikationer såsom konditionering regim toxicitet, infektion eller medicinering biverkningar. Genom användningen av proteomik strategier och hög genomströmning validering använder sekventiell ELISA, har vi identifierat 6 proteiner vars koncentrationer förhöjda vid debuten för kliniska manifestationer av GVHD. IL-2Ra, TNFR1, HGF och IL-8, när de kombineras i en 4-biomarkör panelen kan diagnostisera GVHD vid början av kliniska symtom och kan förutsäga efter HSCT överlevnad oberoende av GVHD svårighetsgrad 1. Elafin, en biomarkör för GVHD av skin kan skilja mellan GVHD utslag och utslag av andra orsaker, t.ex. läkemedel utbrott och kan förutsäga transplantation överlevnad 2. Vi har nyligen identifierat REG3α som en biomarkör av GVHD i den nedre mag-tarmkanalen, de flesta målorganet associerad med NRM. Plasma REG3α koncentration kan tillförlitligt identifiera GVHD som orsak för post-HSCT diarré och korrelerar till histologiska svårighetsgraden av GVHD på diagnostiska tarmbiopsier. REG3α koncentrationer vid GI GVHD början kan också förutsäga känslighet för GVHD terapi och NRM 3. Införlivandet av dessa validerade GVHD biomarkörer i klinisk vård utreds för närvarande i kliniska prövningar. Dessa experiment utfördes på små plasma alikvoter som samlats in från patienter som HSCT mellan 2000 och 2010 i samband med GVHD debut som är oersättliga och begränsad mängd. På grund av den dyrbara naturen hos dessa prover, har vi utvecklat en metHod att mäta flera plasma protein på ett effektivt, reproducerbart sätt för att eliminera överskott frys-tö cykler, tina tid och plasma-användning. Denna teknik kan användas för att utföra ELISA för flera proteiner / cytokiner av intresse på samma prov (er) under förutsättning att proven inte behöver blandas med andra reagens. Om ELISA kit inte kommer med förbelagda plattor, 96-brunns halv-brunnars plattor eller 384-brunnars plattor kan användas för att ytterligare minimera användningen av prover / reagens. Detta manuskript fokuserar på de tekniska aspekterna av att mäta GVHD biomarkörer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Humant IL-2 R alpha DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> Humant HGF DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> Humant IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550.999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match MONTERING Human PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Human sTNFRI/TNFRSF1A DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Human Trappin-2/Elafin DuoSet </td><td> FoU Syhärrör </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-väl polystyren koniska bottenplattor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249.570 </td><td> Används för plasma källplattor </td></tr><tr><td> Costar halv brunnar hög bindande 96-brunnsplattor </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> För IL-2Ra, HGF, TNFR1 och elafin ELISA </td></tr><tr><td> Nunc 384-brunnars plattor MaxiSorp </td><td> Nunc </td><td> 464.718 </td><td> För REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Fosfatbuffrad saltlösning, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin, fraktion V, värmechock behandlad </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker BLOTTO i TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37.530 </td><td> Blockeringsmedel för IL-2Ra HGF och TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> DulbeccosFosfatbuffrad saltlösning </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> Tvättbuffert för IL-2Ra, HGF, Elafin och TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> TMB Peroxid Susbtrate </td><td> Kirkegaard och Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> Tvättbuffert för IL-2Ra, HGF, Elafin och TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> Svavelsyra </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84.720 </td><td> (Utspädd till 2N) för stopp-lösning </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Objektiva upptäckt proteomik strategier har potential att identifiera ett stort antal nya biomarkörer som kan förbättra diagnostik och prognostisk tester i en klinisk miljö och kan hjälpa guide terapeutiska ingrepp. När ett stort antal kandidat proteiner identifieras, kan det vara svårt att validera kandidat biomarkörer i ett snabbt och effektivt sätt från patientprover plasmaprover som är händelsestyrd, av ändlig volym och oersättliga, såsom i början av akut graft-versus- värdsjukdom (GVHD), en potentiellt livshotande komplikation av allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT). Här beskriver vi processen med att utföra kommersiellt tillgängliga ELISA för sex validerade GVHD proteiner: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2 och REG3α 3 (även känd som PAP1) i ett sekventiellt sätt för att minimera frysnings-upptiningscykler, Tinade plasma tid och plasma användning. För denna procedur vi utför ELISA i ordningsföljd som bestäms av prov utspädningsfaktor fastställts i vårt laboratorium med tillverkarens ELISA kit och protokoll med mindre justeringar för att underlätta optimal sekventiell ELISA prestanda. De resulterande plasma biomarkörer koncentrationer kan sedan sammanställas och analyseras för viktiga resultat inom en patient kohort. Medan dessa biomarkörer för närvarande för forskningsändamål endast är deras införlivande i klinisk vård utreds för närvarande i kliniska prövningar. Denna teknik kan användas för att utföra ELISA för flera proteiner / cytokiner av intresse på samma prov (er) under förutsättning att proven inte behöver blandas med andra reagens. Om ELISA kit inte kommer med förbelagda plattor, 96-brunns halv-brunnars plattor eller 384-brunnars plattor kan användas för att ytterligare minimera användningen av prover / reagens.

<html> Den biomarkör arbetsflöde och tidslinje beskrivs i tabell 1 och tabell 2, respektive. När de är färdiga, koncentrationer av 6 olika proteiner har nu kvantifieras på samma plasmaprovet användning av totalt 150 | il plasma. Plätering av proverna i två exemplar per test möjliggör intern kvalitetssäkring, med CV mindre än 10% är optimalt. Om du utför den sekventiella ELISA på flera plattor, konsekvent optiska densiteter av den höga standarden är att föredra och möjliggöra bättre mellan plattorna tillförlitlighet mätningar, standardkurva OD kan jämföras mellan plattorna för att söka bedöma för inkonsekvens i ELISA prestanda (figur 2). Development gånger med tetrametylbensidin kolorimetriskt substrat och hög koncentration OD observerades för varje biomarkör i vårt laboratorium anges i tabell 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Bild 1 &quot;/&gt; Figur 1. Arbetsflöde för IL-2Ra, REG3α och HGF ELISA. Efter plasmaproverna har pläteras på de IL-2Ra ELISA testplattor det återvinns att utspädning källplattor för andra ELISA. För HGF ELISA är plasman återvinns för att framställa 01:06 utspädning plattan för IL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för större figur</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Optiska densiteter för standardkurvan av 7 olika ELISA-plattor mäter REG3α koncentrationer motsvarande de 1084 patienter som testats för den inledande REG3α GI GVHD biomarkör rapport 3. Konsekvent OD mellan plattorna säkerställer konsekventa mätningar proteinkoncentration mellan plattorna. Koncentrationer av proteineri plasma prover beräknas genom att jämföra prov optiska densiteter med standardkurvan optiska densiteter. <table border="1"><tbody><tr><td> Experiment Dag 0 </td><td> 1. Förbered prover </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Ra, HGF och REG3α fånga Ab </td></tr><tr><td> Experiment Dag 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF-ELISA (genom prov plätering) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin och TNFR fånga Ab </td></tr><tr><td> Experiment Dag 2 </td><td> 1. HGF ELISA färdigställande </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8-ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Frysas på nytt oanväntplasma </td></tr></tbody></table> Tabell 1. GVHD Biomarker arbetsflöde Översikt <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Dag 0 </td><td colspan="3"> Provberedning och övernattning fånga kropp inkubation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Ra </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Tid (h) </td><td> 0,0 </td><td> Blockering </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Förgyllda prover </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclaim plasmaprover, Detection Ab </td><td> Blockering, förbered Prover (1:10 spädning) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td> Prover guldpläterade (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> Detektering Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td> Plattläsande </td><td> TMB </td><td> Blockering, förbered prover (1:2 utspädning) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Plattläsande </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td> Prover guldpläterade (1:2) </td><td> Capture Ab (inkubering över natten) </td><td> Capture Ab (inkubering över natten) </td><td></td></tr><tr><td> Dag 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tid (h) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim plasma, Detection Ab </td><td> Blockering, förbered prover (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Prov plätering (1:2) </td><td> Blockering, Ytterligare spädning av 1:20 prov 1:25 utspädning </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Prov plätering (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Plattläsande </td><td> Detektering Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Förbered prover (1:6 utspädning) </td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Detektering Ab </td><td> Prov plätering (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Plattläsande </td&gt; <td> HRP </td><td> Detektering Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plattläsande </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plattläsande </td></tr><tr><td colspan="2"> Efter fullbordan </td><td colspan="6"> Byt källa plasma i portioner och frysa för senare användning </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Tidslinje för att utföra ELISA. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plasma Utspädningsfaktor </td><td> Hög standard Koncentration </td><td> Substrat Development Tid (min) </td><td> Hög OD </td><td> Kurva </td></tr><tr><td> IL-2Ra </td><td> 01:01 </td><td> 2.000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Linjär </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4.000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-parametern </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-parametern </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-parametern </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1:20 </td><td> 2.000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-parametern </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Linjär </td></tr></tbody></table> Tabell 3. ELISA Detaljer för 6 GVHD biomarkörer.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Hög genomströmning validering av flera kandidat biomarkörer kan utföras genom sekventiell ELISA i syfte att minimera frysnings / upptiningscykler och användning av dyrbara plasmaprover. Här visar vi hur sekventiellt för att utföra ELISA för sex validerade olika plasma biomarkörer<sup&gt; 1-3</sup&gt; Av transplantat-mot-värd-sjukdom (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; På samma plasmaprov.

Hög genomströmning Sekventiell ELISA för validering av biomarkörer för akut graft-versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

En hög kapacitet automatiserad plattform för utveckling av tillverkning cellinjer för proteinläkemedel

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Mus Eye enucleation för Remote hög kapacitet Fenotypning

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekventiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Osteogena Stem / progenitorceller Under Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Minimal invasiv kirurgisk procedur att inducera hjärtinfarkt hos möss

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Hög genomströmning karakterisering av vuxna stamceller Engineered för leverans av terapeutiska faktorer för Nervskyddande Strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

Upptäckt av sjukdomsassocierade α-synuklein genom förbättrade ELISA i hjärnan hos transgena möss som överuttrycker Human A53T Mutated α-synuklein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

En hög genomströmning, Multiplex och riktade proteomik CSF analys för att kvantifiera neurodegenerativa Biomarkers och apolipoprotein E isoformer Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Studie av In Vivo glukosmetabolismen i fettrik kost-matade möss använder Oral glukostoleranstest (OGTT) och Insulin tolerans Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Digital PCR för kvantifiering av cirkulerande mikroRNA i akut hjärtinfarkt och hjärt-kärlsjukdom

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...