Name: high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

NIH hibe RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​Hartwell Vakfı ve Doris Duke Vakfı tarafından desteklenir. Dr Paczesny Eric Hartwell fonu ve Amy Strelzer Manasevit Araştırma Programı bir dedektiftir.

1. Deney Gün 0: IL-2Rα, REG3α ve HGF için Yakalama Antikor ile Numune Hazırlama ve ELISA Testi Levha Kaplama <ol><li> Analiz edilecek Plazma kısım örnekler çözülmüş ve plazma üst alt ve lipidler de pıhtıları ayırmak için 10 dakika 12.000 rpm&#39;de bükülmüş, çekilecektir. Seyreltilmemiş plazma 150 ul önceden haritalarına göre manuel pipetleme ile (kaynak plaka) bir 96-gözlü V-alt plaka üzerine her bir numuneden kaplanmış olacaktır. Alikotları parafilm sarılmış ve tüm süreç boyunca 4 ° C&#39;de nemli odasında muhafaza edilecektir; artık daha 72 saat. </li><li> IL-2Rα ve HGF yakalama antikorlar sulandırılır ve üretici teknik özellikleri ve 50 ul başına seyreltilmiş sonra sızdırmaz ve 4 gecede inkübe edilir ilgili 96-de yüksek bağlayıcı yarım kuyucuğu her iyi ° C içine kaplama olacak olacak Alternatif olarak, çok sayıda plaka 37 ° C sıcaklıkta kurutuldu ve ° C daha sonra kullanılmak üzere, bağlı 4 saklanabilirprotein istikrarı ing. </li><li> REG3α yakalama antikor sonra mühürlenir ve 4 de bir gece inkübe edilir bir 384-kuyucuklu Nunc Maxi Sorp-plakanın her ° C &#39;de kaplanmış olacaktır üretici kaplama tamponu ve 25 ul kullanılarak üreticinin protokolüne uygun olarak seyreltilebilir olacaktır </li></ol> 2. Deney 1. Gün: IL-2Rα ELISA (Şekil 1) <ol><li> IL-2Rα test plakasına, yıkanmış TBS içinde Blotto ile bloke ve standart kurulur ve 8 noktalı bir standart eğri üretici protokolüne göre hazırlanır. </li><li> Bloke etme adımı aşağıdaki plaka yıkandıktan sonra, plazma sulandırılmamış 50 ul kaynak plaka plaka ELISA testi için suret halinde kaplama olup, her bir standart 50 ul kopya halinde kaplıdır. Plaka 300 rpm&#39;de ayarlanmış bir plaka döndürücü üzerine kapatılmış ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedir. </li><li> Plazma IL-2Rα ELISA testi plaka geri istenmeye ve un geri yerleştirilirplazma kaynağı plakası seyreltilir. ELISA imalatçı protokolü (yarı oyuklu plakalar için düzeltilmiş hacim ile) ve 450-570 nm dalga boyuna sahip bir plaka okuyucu kümesi kullanılarak okunacak her çukurun optik yoğunluk göre tamamlandı ve veriler kaydedilir ve analiz edilir. </li></ol> 3. Deney 1. Gün: REG3α ELISA (Şekil 1) <ol><li> Seyreltilmemiş 10 ul plazma bir ayrı v-alt kaynak plakasına transfer edilir. Imalatçı tarafından sağlanan seyreltme tamponu 90 ul bir 1:10 seyreltme kaynak plaka oluşturmak için her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> REG3α ELISA üretici protokolüne göre yapılır (hacimli 384-kuyucuğu için düzeltilmiş) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-620 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve veriler kaydedilir ve analiz edilecektir. </li></ol> 4. Deney 1. Gün: Elafin ve Capture Antikor ile TNFR1 Testi Levha Kaplama <ol><li> Elafin ve TNFR1 yakalama antikorlar sulandırılmış ve dil olacaküretici şartname ve 50 ul başına uted sonra mühürlenir ve Elafin için oda sıcaklığında bir gece inkübe edilir sırasıyla 96-de yüksek bağlayıcı yarı oyuklu plakalar her oyuğuna kaplama, ve 4 ° C sıcaklıkta TNFR1 için olacaktır. </li></ol> 5. Deney Gün 1-2: HGF ELISA (Şekil 1) <ol><li> IL-2Rα ELISA tamamlanması ve deney temin sonra tekrar edilmesi gerekmez, seyreltilmemiş ve 60 ul plazma yeni bir kaynak plaka aktarılır ve daha sonra 1 x PBS içinde% 1 BSA ve 60 ul bir hale getirmek için her bir oyuğa ilave edilir 01:02 seyreltilmiş plazma kaynağı plakası. </li><li> HGF test plakasına, yıkanmış TBS içinde Blotto ile bloke ve standart kurulur ve 8 noktalı bir standart eğri üretici protokolüne göre hazırlanır. </li><li> Bloke etme adımı aşağıdaki plaka yıkandıktan sonra, 1:2 seyreltilmiş plazma 50 ul ELISA testi plaka üzerinde kopya halinde kaplama olup, her bir standart 50 ul kopya halinde kaplıdır. Plakası kapatılmış ve300 rpm&#39;de ayarlanmış bir plaka Döndürücü üzerinde gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. </li><li> 1:2 seyreltilmiş plazma HGF ELISA testi plaka geri istenmeye ve 1:2 seyreltilmiş plazma kaynağı plaka geri yerleştirilir. ELISA imalatçı protokolü (yarı oyuklu plakalar için düzeltilmiş hacim ile) ve 450-570 nm dalga boyuna sahip bir plaka okuyucu kümesi kullanılarak okunacak her çukurun optik yoğunluk göre tamamlandı ve veriler kaydedilir ve analiz edilir. </li></ol> 6. Deney 2. Gün: Elafin ELISA <ol><li> Seyreltilmemiş 10 ul plazma yeni bir kaynak plaka transfer edilir ve daha sonra 1 x PBS içinde% 1 BSA, 190 ul plazma dluted 1:20 200 ul olmak için her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> Elafin ELISA olarak 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacaktır üreticisi protokolü (hacimleri ile yarı-kuyucuğu için düzeltilmiş) ve her kuyu optik yoğunluğuna göre yapılır ve veriler kaydedilir ve analiz. </li></ol> 7. Deneme Day 2: ELISA TNFR1 <ol><li> PBS içinde% 1 BSA ve 25 ul 1:25 seyreltilmiş 125 ul plazma elde etmek için 1:20 kaynak plaka (şimdi 01:20 plazma ihtiva eden 100 ul) eklenir. </li><li> TNFR1 ELISA üretici protokole göre tamamlanmış (yarım-kuyucuğu için ayarlanabilir hacimli) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve verilerin kaydedilmesini ve analiz. </li></ol> 8. Deney 2. Gün: IL-8 ELISA <ol><li> 1:02 seyreltilmiş ve 60 ul plazma yeni bir kaynak plaka aktarılır ve daha sonra IL-8 seyreltici, 180 ul plazma bir 1:06 seyreltilmiş kaynak plakası olmak için her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> IL-8 ELISA üretici protokole göre tamamlanmış (yarım-kuyucuğu için ayarlanabilir hacimli) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve verilerin kaydedilmesini ve analiz. </li></ol> Tüm ELISA&#39;lar, unuse tamamlandıktan sonrad stok plazma çözülmüş alikotları içine değiştirilir ve ileride kullanmak için dondurulmuş olacaktır.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Burada sunulan sıralı ELISA yöntemi örneğin fare 9,10 elde nadir hastalıklar veya plazma örnekleri ile insan denekler örnekleri de yeri doldurulamaz edinme ve / veya zor olabilir plazma küçük hacimlerde birden fazla plazma proteinlerinin ölçümü sağlar. Sıralı ELISA&#39;lar genellikle gerektiren ELISA&#39;lar ile artan plazma seyreltme faktörü amacıyla yapılan plazma seyreltilmiş ≥ genellikle istenirse bu yapılabilir, ancak iadesi olmaya gerek yok 01:10. Vardır Ardışık ELISA gerçekleştirmek için yetenek plazma diğer reaktifler ile karıştırıldığında ya da farklı olan seyreltme tampon plazma için gerekli olan ELISA kitleri / protokoller ile sınırlıdır, bu yeniden kullanımı bir örnek dolayı bir uyumsuz kaygılar ablility engellemektedir tampon / reaktif Belirli bir testin performansını etkileyecektir. Dikkatli planlama ile, 10 ya da daha fazla aynı ELISA&#39;lar plazma örneği üzerinde gerçekleştirilebilir. ent &quot;&gt; Bireysel laboratuarlarda denek gelen örneklerde ilgi protein beklenen plazma konsantrasyonlarına dayalı yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için plazma dilüsyonları ayarlamanız gerekebilir. laboratuar ekipmanları farklılıklar inkübasyon ve kolorimetrik geliştirme optimize etmek için ihtiyaç neden olabilir kez, yıkar sayısı ve / veya yıkama herhangi bir ELISA optimize etmek amacıyla kez ıslatın. High-throughput kapasitesi ve doğruluğu artırmak için ve maliyet-etkin bir şekilde analizler yaparak, 384 iyi plakaları üzerinde analiz ve istifleme ünitesi ile otomatik plaka yıkayıcı yeteneğine sahip bir robot sıvı taşıma platform kullanımı tavsiye edilir. Bu cihaz birden fazla kullanıcı tarafından yapılan analizlerin doğruluğunu ve hassasiyetini artırmak, ve inter-ve intra-analiz varyasyonu azaltmak için analiz tutarlılığı sağlamaya yardımcı olabilir. ) 1 çoğu: Biz iki nedenden dolayı mevcut multipleks platformlar üzerinde sıralı ELISAroman proteinler için antikor çiftleri kolayca boncuk veya diğer malzemelerin üzerine konjuge yanı sıra, zaman alıcı ve pahalı olamaz; 2) Bireysel ELISA deneyleri çapraz reaktivite 11 yokluğu sekonder multipleks mikroarray veya boncuklar, daha kesindir. Güvenilir bir yöntem çoğaltılmış, boncuk esaslı mikrodizileri gerçekleştirmek için kurulmuştur, bu ardışık ELISA işlemi yerine mümkün olabilir, fakat boncuklar ve / eşlenik antikorların yeteneğini ya da olması istenen proteinlerin sayısı ile sınırlıdır edilebilir analiz.

Akut graft-versus-host hastalığı (GVHD), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) sonrasında non-relaps mortalite (UYM) önde gelen nedeni, üç organ sistemi disfonksiyonu ile ölçülür: deri, karaciğer ve gastrointestinal (Gİ) yolu 4. Akut GVHH genellikle iki ila sekiz hafta nakli sonra oluşur ancak daha sonra ortaya çıkabilir ve genellikle rejimin toksisite, enfeksiyon veya ilaç yan etkileri gibi diğer post-HKHT komplikasyonlar klinik olarak ayirt olduğunu. Sıralı ELISA kullanılarak proteomik stratejileri ve high-throughput doğrulama kullanımı sayesinde, kimin konsantrasyonları GVHH klinik belirtilerin başlangıcında yükselir 6 proteinler belirledik. 4 biyomarker paneli birleştirilir IL-2Rα, TNFR1, HGF ve IL-8, klinik semptomların başlangıcında GVHD teşhis edebilir ve bağımsız GVHH şiddeti 1 post-HKHT sağkalım tahmin edebilirsiniz. Elafin, sk GVHH için bir biyomarker, bu tür ilaç döküntüleri gibi diğer nedenler GVHH döküntü ve döküntü ayırt edebilir ve nakli sağkalım 2. tahmin edebilirsiniz. Biz son zamanlarda alt gastrointestinal GVHH bir biyomarker olarak REG3α belirledik, hedef organ en UYM ile ilişkilidir. Plazma REG3α konsantrasyonu güvenilir post-HKHT ishal nedeni olarak GVHD tespit ve teşhis barsak biyopsilerde GVHH histolojik şiddeti ilişkili olabilir. GI GVHH başlangıcında REG3α konsantrasyonları da GVHH tedavisi ve UYM 3 yanıt tahmin edebilirsiniz. Klinik bakım içine bu valide GVHH biyobelirteçlerin birleşme anda klinik çalışmalarda araştırılmaktadır. Bu deneyler yeri doldurulamaz ve sınırlı büyüklüktedir GVHH başlama zamanında 2000 ve 2010 yılları arasında HKHT alan hastalardan toplanan küçük plazma alikotları yapıldı. Bu örneklerin değerli doğası gereği, biz bir araya geldi geliştirdikaşırı donma-çözülme döngüleri, çözünme zamanı ve plazma kullanımını ortadan kaldırmak için etkili, tekrarlanabilir bir şekilde birden fazla plazma protein konsantrasyonu ölçüm hod. Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA&#39;da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir. Bu yazıda GVHH biyolojik ölçüm teknolojik yönleri üzerinde duruluyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnsan IL-2 Duoset R alfa </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan HGF Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan IL-8 OptEIA TAKIMI II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match MONTAJ İnsan PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL Uluslararası </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Takımı </td><td> MBL Uluslararası </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> Ar-Ge Sykaynaklanıyor </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-polistiren konik alt plakalar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Plazma kaynağı plakaları için kullanılır </td></tr><tr><td> Costar yarım sıra yüksek bağlayıcı 96 oyuklu plakalar </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> IL-2Rα, HGF, TNFR1 ve elafin ELISA&#39;lar için </td></tr><tr><td> Nunc 384-iyi MaxiSorp plakaları </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> REG3α Elisa için </td></tr><tr><td> HyClone Fosfat, 1x Tamponlu Salin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin, Fraksiyon V, Tedavi Isı Şoku </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> TBS içinde Engelleyicisi Blotto </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> IL-2Rα HGF ve TNFR1 ELISA&#39;lar için engelleme ajan </td></tr><tr><td> DulbeccoTuzlu Fosfat-Buffered </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin ve TNFR1 ELISA&#39;lar için tampon yıkayın </td></tr><tr><td> TMB Peroksit Susbtrate </td><td> Kirkegaard ve Perry Laboratuvarları </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin ve TNFR1 ELISA&#39;lar için tampon yıkayın </td></tr><tr><td> Sülfürik Asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (2N Seyreltilmiş) stop çözüm </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Tarafsız keşif proteomik stratejiler klinik ortamda tanısal ve prognostik test artırabilir ve kılavuz terapötik girişimlere yardımcı olabilecek yeni biyomarkerler sayıda tanımlamak için bir potansiyele sahiptir. Aday proteinleri çok sayıda tespit edildiğinde, bu tür akut başlangıçlı itibariyle sonlu hacim, olay odaklı ve yeri doldurulamaz olan hasta plazma numuneleri, bir zamanında ve verimli bir şekilde aday biyobelirteçlerin doğrulamak zor olabilir graft-versus- host hastalığı (GVHH), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) bir potansiyel olarak yaşamı tehdit eden bir komplikasyondur. En aza indirmek için ardışık bir şekilde IL-2Rα 5, 6 TNFR1, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, 3 ve REG3α (aynı zamanda PAP1 olarak da bilinir): Burada altı doğrulanmış GVHD proteinler için ticari olarak mevcut ELISA&#39;lar gerçekleştirme işlemini tarif donma-çözülme döngüleri, Plazma zaman ve plazma kullanımı çözülmüş. Optimum sıralı ELISA performansı kolaylaştırmak için küçük ayarlamalar ile üretici ELISA kitleri ve protokollerini kullanarak Laboratuvarımızda kurulmuş olarak örnek seyreltme faktörü ile belirlenir, bu işlem için biz sırayla ELISA&#39;lar gerçekleştirin. Çıkan plazma biyolojik konsantrasyonları sonra derlenen ve bir hasta kohort içinde önemli bulgular için analiz edilebilir. Bu biyobelirteçlerin sadece araştırma amaçlı anda olsa da, klinik bakım onların içine eklenmesi halen klinik çalışmalarda araştırılmaktadır. Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA&#39;da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir.

<html> Biyomarker iş akışı ve zaman çizelgesi, sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2&#39;de ayrıntılı olarak verilmektedir. Bir kere tamamlandı, 6 farklı protein konsantrasyonu hemen plazma 150 ul toplam plazma kullanılarak aynı numune üzerinde ölçülebilir edilmiştir. Test başına nüsha örnekleri Kaplama CV% 10&#39;un altında optimum olmak üzere, iç kalite güvence sağlar. Çok plakalı, yüksek standartları tutarlı optik yoğunlukları üzerinde sıralı ELISA gerçekleştirerek tercih ve ölçümlerin gelişmiş arası plaka güvenilirlik için izin iseniz; standart eğri ODS ELISA performansı tutarsızlık (Şekil 2) için değerlendirmek bakmak plakaları arasındaki mukayese edilebilir. Tetrametilbenzidin kolorimetrik alt tabaka ve yüksek konsantrasyon kullanılarak ODS Development kez laboratuarımızda her bir biyolojik için gözlenen Tablo 3 de listelenmiştir. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;/&gt; Şekil 1. IL-2Rα, REG3α ve HGF ELISA&#39;lar için iş akışı. Plazma örnekleri, IL-2Rα ELISA plakaları üzerinde kaplanmış edildikten sonra, diğer ELISA&#39;lar için seyreltme kaynak plakaları yapmak için yapıştırılır. HGF ELISA için, plazma IL-8 1:06 seyreltme plaka hazırlamak için yapıştırılır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam için tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. İlk REG3α GI GVHH biyomarker raporu 3 test 1084 hastaya karşılık REG3α konsantrasyonlarını ölçmek 7 farklı ELISA plakaları standart eğri için optik Yoğunlukları. Plakalar arasındaki Tutarlı ODS plakaları arasında tutarlı protein konsantrasyonu ölçümleri sağlamak. Protein konsantrasyonlarıplazma numuneleri standart eğri optik yoğunlukları numunenin optik yoğunlukları karşılaştırılarak hesaplanmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td> Deney Gün 0 </td><td> 1. Örnekler hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF ve REG3α yakalama Ab </td></tr><tr><td> Deney 1. Gün </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (örnek sayesinde kaplama) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin ve TNFR yakalama Ab </td></tr><tr><td> Deney 2. Gün </td><td> 1. HGF ELISA tamamlama </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Kullanılmayan dondurulabilirplazma </td></tr></tbody></table> Tablo 1. GVHH Biyomarker İş Akışına Genel Bakış <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Gün 0 </td><td colspan="3"> Numune hazırlama ve geceleme yakalama vücut inkübasyon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Süresi (saat) </td><td> 0.0 </td><td> Bloke etme </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td> Kaplama, Örnekleri </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td> Algılama Ab; plazma numuneleri Reclaim </td><td> Engelleme; Prepare Örnekleri (1:10 seyreltme) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> Kaplama Örnekleri (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> Algılama Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> Plaka Okuma </td><td> TMB </td><td> Engelleme; Prepare örnekleri (1:2 seyreltme) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td> Plaka Okuma </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td> Kaplama Örnekleri (1:2) </td><td> Ab (gecelik inkübasyon) Yakalama </td><td> Ab (gecelik inkübasyon) Yakalama </td><td></td></tr><tr><td> 2. Gün </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Süresi (saat) </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td> Plazma, Algılama Ab Reclaim </td><td> Engelleme; Prepare örnekleri (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Örnek kaplama (1:2) </td><td> Engelleme; 01:20 örneklerin ilave seyreltme 1:25 seyreltme </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Örnek kaplama (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td> Plaka Okuma </td><td> Algılama Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Örnekleri (1:6 seyreltme) hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Algılama Ab </td><td> Örnek kaplama (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td> Plaka Okuma </td&gt; <td> HRP </td><td> Algılama Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plaka Okuma </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plaka okuma </td></tr><tr><td colspan="2"> Tamamlanmasından sonra, </td><td colspan="6"> Alikotları içine kaynak plazma değiştirin ve daha sonra kullanmak için dondurma </td></tr></tbody></table> Tablo 2. ELISA&#39;lar gerçekleştirmek için zaman çizelgesi. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plazma Seyreltme faktörü </td><td> Yüksek Standart Konsantrasyon </td><td> Yüzey Geliştirme Süresi (dk) </td><td> Yüksek OD </td><td> Eğri </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01:01 </td><td> 2,000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Doğrusal </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4.000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01:20 </td><td> 2,000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td> Doğrusal </td></tr></tbody></table> 6 GVHH Biyobelirteçler için Tablo 3. ELISA Detayları.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Birden fazla aday biyobelirteçlerin Yüksek throughput doğrulama donma / çözülme çevrimleri en aza indirmek ve değerli plazma numunesi kullanmak için sıralı ELISA ile yapılabilir. Burada, sıralı altı farklı valide plazma biyobelirteçleri için ELISA&#39;lar gerçekleştirmek için nasıl göstermek<sup&gt; 1-3</sup&gt; Graft-versus-host hastalığı (GVHH)<sup&gt; 4</sup&gt; Aynı plazma örneği üzerinde.

Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Farelerde Miyokard İnfarktüsü Oluşturan Minimal İnvaziv Cerrahi Prosedür

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Vivo glikoz metabolizması farelerde Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) kullanarak yüksek yağlı diyet beslenen incelenmesi

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...