Name: voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Wij danken onze medewerkers Knut Holthoff, Arthur Konnerth en Marco Canepari die in de initiële ontwikkeling van deze techniek alsook aan Leslie M. Loew deelgenomen voor vriendelijk het verstrekken van kleurstoffen. Ondersteund door NSF subsidie ​​IOS-0817969, NIH beurzen NS068407 en M136043 en door Kavli Instituut voor Neurowetenschappen aan de Yale University.

1. Plaatsing van het apparaat Stap 1.1. Imaging setup De sleutel tot het opnemen van spanning gevoelige kleurstof signalen geschikt setup ontwerp. We maken gebruik van een rechtopstaande microscoop (BX51WI Olympus of Zeiss AxioExaminer) uitgerust met drie camera&#39;s. De setup is ontworpen voor het verlichten van individuele neuronen in de hersenen plakjes door excitatie licht in epi-fluorescentie, wide-field microscopie-modus met behulp van Nikon 60X/1.0 NA of Zeiss...

<ol>
	<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li><li>Cohen, L. B., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+membrane+potential.">Optical measurement of membrane potential.</a> Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).</li><li>Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+overview+and+general+methods+of+membrane+potential+imaging.">Historical overview and general methods of membrane potential imaging.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+signals+from+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons+during+coincident+pre-+and+post-synaptic+activity:+a+combined+voltage-+and+calcium+imaging+study.">Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study.</a> J. Physiol. 580, 463-484 (2007).</li><li>Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+submillisecond+membrane+potential+changes+from+individual+regions+of+single+axons,+dendrites+and+spines.">Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+imaging+from+dendrites+of+mitral+cells:+EPSP+attenuation+and+spike+trigger+zones.">Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones.</a> J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).</li><li>Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+time-course+of+action+potentials+in+spines+and+remote+dendrites+of+mouse+visual+cortical+neurons.">Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons.</a> J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).</li><li>Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+initial+segment+Kv1+channels+control+axonal+action+potential+waveform+and+synaptic+efficacy.">Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy.</a> Neuron. 55, 633-647 (2007).</li><li>Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+of+Stark-shift+voltage-sensing+dyes+by+one-+or+two-photon+excitation+near+the+red+spectral+edge.">High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge.</a> Biophysical J. 87, 631-639 (2004).</li><li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+electrochromic+membrane+probes.">Design and characterization of electrochromic membrane probes.</a> J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).</li><li>Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+use+of+organic+voltage+sensitive+dyes.">Design and use of organic voltage sensitive dyes.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Palmer, L. M., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons.">Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).</li><li>Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+characteristics+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons:+a+voltage+imaging+study.">The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study.</a> J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+absorption,+fluorescence,+dichroism,+and+birefringence+in+stained+giant+axons:+optical+measurement+of+membrane+potential.">Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential.</a> J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).</li><li>Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+action+potential+initiation+in+neocortical+pyramidal+cells:+evidence+from+whole+cell+axon+recordings.">Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings.</a> J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).</li><li>Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+multisite+optical+measurement+of+membrane+potential.">Fast multisite optical measurement of membrane potential.</a> A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).</li><li>Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dendritic Spines. , (2010).</li></ol>

Dit artikel beschrijft een spanningsgevoelige kleurstof registreerwerkwijze voor Electrical activiteit van individuele neuronen met sub-micrometer en een milliseconde spatiotemporele resolutie. Laserexcitatie bij vrijwel optimale golflengte (over signaalgrootte) verbeterde de gevoeligheid van opname met een factor ~ 50 over eerdere benaderingen. De huidige gevoeligheid maakt de controle elektrische signalen uit alle delen van individuele neuronen, met inbegrip van dendrieten, axonen, axon collateralen en axon terminals ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het onderdeel </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Setup componenten </td></tr><tr><td> Upright Microscoop </td><td> Olympus Inc </td><td> BX51WI </td><td> Met drie camera-poorten </td></tr><tr><td> Gemotoriseerde verplaatsbaar podium </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Epi-fluorescentie Condensor voor Olympus BX51 </td><td> TILL Fotonica </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Upright Microscoop </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Met drie camera-poorten </td></tr><tr><td> Gemotoriseerde Top Plate </td><td> Scientifica Limited </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Epi-fluorescentie Condensor voor Zeiss AxioExaminer </td><td> TILL Fotonica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition Camera </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Hoge snelheid, lage ruis lezen </td></tr><tr><td> CCD voor IR-DIC </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning-Disc Confocale Scanner </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> Hoge ruimtelijke resolutie CCD op Confocale Scanner </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 pixels </td></tr><tr><td> DPSS CW laser (532 nm) </td><td> CNI Optoelectronics Tech. Co, Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Excitatielichtbron </td></tr><tr><td> Multi-Mode Fiber Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Light Guide </td><td> TOT Fotonics </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Sluiter </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Vibration Isolation Tabel </td><td> Minus k Technology </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Specifieke reagentia </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Life Technologies </td><td> D-6923 </td><td> Voltagegevoelige kleurstof </td></tr><tr><td> Crym-EGFP Mouse Line </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Dun uitdrukken EGFP in Laag 5 corticale neuronen </td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices

Het begrijpen van de biofysische eigenschappen en functionele organisatie van enkele neuronen en hoe ze informatie verwerken is essentieel om te begrijpen hoe de hersenen werken. De primaire functie van een zenuwcel is om elektrische signalen te verwerken, gewoonlijk uit meerdere bronnen. Elektrische eigenschappen van neuronale processen buitengewoon complex dynamisch en, in het algemene geval, onmogelijk te voorspellen in afwezigheid van gedetailleerde metingen. Om een ​​dergelijke meting zou worden verkregen, ideaal, wil graag in staat zijn om, monitoren op meerdere plaatsen, subdrempel gebeurtenissen als ze reizen van de sites van de oorsprong op de neuronale processen en summate op bepaalde locaties te actiepotentiaal initiatie beïnvloeden. Dit doel is niet bereikt in een neuron als gevolg van technische beperkingen van metingen die elektroden gebruiken. Te overwinnen dit nadeel is het zeer wenselijk om de patch-elektrode benadering vullen met beeldvormingstechnieken die uitgebreide parallel staan ​​recordings uit alle delen van een neuron. We beschrijven een dergelijke techniek - optische registratie van membraanpotentiaal transiënten met organische spanningsgevoelige kleurstoffen (V m-imaging) - gekenmerkt door een milliseconde en sub-micrometer resolutie. De methode is gebaseerd op pionierswerk op spanningsgevoelige moleculaire probes 2. Veel aspecten van de initiële technologie zijn er continu verbeteringen over meerdere decennia 3, 5, 11. Bovendien eerder werk beschreven twee essentiële kenmerken van V m-imaging. Ten eerste fluorescentiesignalen zijn recht evenredig met membraanpotentiaal over het gehele fysiologische bereik (-100 mV tot +100 mV, 10, 14, 16). Ten tweede wordt geladen neuronen met de spanningsgevoelige kleurstof hier gebruikte (JPW 3028) geen detecteerbare farmacologische effecten. De opgenomen verbreding van de piek tijdens de kleurstof laden is volledig omkeerbaar 4, 7. Bovendien experimenten is aangetoond dat het mogelijk is te verkrijgeneen groot aantal (tot honderden) opnames vóór elke detecteerbare fototoxische effecten 4, 6, 12, 13. Er profiteren van de uitstekende helderheid en stabiliteit van een laser lichtbron met nagenoeg optimale golflengte de gevoeligheid van de V-m beeldvormingstechniek maximaliseren. De huidige gevoeligheid maakt het mogelijk meerdere locaties optische opnamen van V m transiënten uit alle delen van een neuron, met inbegrip van axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines. De verkregen gegevens over interacties signaal kwantitatief worden als direct gevisualiseerd in de vorm van een film geanalyseerd.

Succesvolle confocale microscopie moet tot duidelijke identificatie van intact neuronale processen die dicht bij het oppervlak van de plak en in een vlak van focus. De selectie van zenuwcellen die geschikt zijn voor spanning beeldvorming voorafgaand aan de voltage-gevoelige kleurstof laden is van cruciaal belang. Een voorbeeld van confocale beelden van L5 piramidale neuronen die EGFP in een corticaal segment (Crym transgene muizenlijn) wordt getoond in figuur 2. Axonen van individuele neuronen duidelijk...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...