Name: voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Vi er takknemlige for våre samarbeidspartnere Knut Holthoff, Arthur Konnerth og Marco Canepari som deltok i den første utviklingen av denne teknikken samt Leslie M. Loew for vennlig gi fargestoffer. Støttet av NSF stipend IOS-0817969, NIH tilskudd NS068407 og M136043 og ved Kavli Institute for Neuroscience ved Yale University.

1. Utstyr Setup Trinn 1.1. Imaging oppsett Nøkkelen til opptak spenningsstyrte dye signaler er riktig oppsett design. Vi bruker en oppreist mikroskop (BX51WI Olympus eller Zeiss AxioExaminer) utstyrt med tre kameraer. Oppsettet er utviklet for belysning individuelle nerveceller i hjernen skiver av eksitasjon lys i epi-fluorescens, wide-felt mikroskopi modus ved hjelp av enten Nikon 60X/1.0 NA eller Zeiss 63X/1.0 NA vann dipping mål. Våre mikroskoper er boltet til e...

<ol>
	<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li><li>Cohen, L. B., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+membrane+potential.">Optical measurement of membrane potential.</a> Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).</li><li>Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+overview+and+general+methods+of+membrane+potential+imaging.">Historical overview and general methods of membrane potential imaging.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+signals+from+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons+during+coincident+pre-+and+post-synaptic+activity:+a+combined+voltage-+and+calcium+imaging+study.">Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study.</a> J. Physiol. 580, 463-484 (2007).</li><li>Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+submillisecond+membrane+potential+changes+from+individual+regions+of+single+axons,+dendrites+and+spines.">Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+imaging+from+dendrites+of+mitral+cells:+EPSP+attenuation+and+spike+trigger+zones.">Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones.</a> J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).</li><li>Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+time-course+of+action+potentials+in+spines+and+remote+dendrites+of+mouse+visual+cortical+neurons.">Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons.</a> J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).</li><li>Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+initial+segment+Kv1+channels+control+axonal+action+potential+waveform+and+synaptic+efficacy.">Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy.</a> Neuron. 55, 633-647 (2007).</li><li>Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+of+Stark-shift+voltage-sensing+dyes+by+one-+or+two-photon+excitation+near+the+red+spectral+edge.">High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge.</a> Biophysical J. 87, 631-639 (2004).</li><li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+electrochromic+membrane+probes.">Design and characterization of electrochromic membrane probes.</a> J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).</li><li>Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+use+of+organic+voltage+sensitive+dyes.">Design and use of organic voltage sensitive dyes.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Palmer, L. M., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons.">Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).</li><li>Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+characteristics+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons:+a+voltage+imaging+study.">The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study.</a> J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+absorption,+fluorescence,+dichroism,+and+birefringence+in+stained+giant+axons:+optical+measurement+of+membrane+potential.">Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential.</a> J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).</li><li>Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+action+potential+initiation+in+neocortical+pyramidal+cells:+evidence+from+whole+cell+axon+recordings.">Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings.</a> J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).</li><li>Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+multisite+optical+measurement+of+membrane+potential.">Fast multisite optical measurement of membrane potential.</a> A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).</li><li>Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dendritic Spines. , (2010).</li></ol>

Denne artikkelen beskriver en spenning-sensitive dye opptak metode for å overvåke elektriske aktiviteten enkelte nerveceller med sub-mikrometer og sub-millisekund Spatiotemporal oppløsning. Laser eksitasjon ved nær-optimal bølgelengde (angående signal størrelse) forbedret følsomhet opptaket med en faktor på ~ 50 over tidligere tilnærminger. Den nåværende følsomhet gjør overvåking elektriske signaler fra alle deler av individuelle nevroner, inkludert dendritter, aksoner, axon collaterals og axon terminaler...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på komponenten </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Oppsett komponenter </td></tr><tr><td> Upright Microscope </td><td> Olympus Inc. </td><td> BX51WI </td><td> Med tre kamera porter </td></tr><tr><td> Motorisert Movable Stage </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Epi-fluorescens Kondensator for Olympus BX51 </td><td> TILL Photonics </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Upright Microscope </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Med tre kamera porter </td></tr><tr><td> Motorisert Topplate </td><td> Scientifica Limited </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Epi-fluorescens Kondensator for Zeiss AxioExaminer </td><td> TILL Photonics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition Camera </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Høy hastighet, lavt lese støy </td></tr><tr><td> CCD for IR-DIC </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning-Disc Confocal Scanner </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> Høy romlig oppløsning CCD på Confocal Scanner </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 piksler </td></tr><tr><td> DPSS CW Laser (532 Nm) </td><td> CNI Optoelectronics Tech. Co, Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Eksitasjon lyskilde </td></tr><tr><td> Multi-Mode Fiber Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Lys over </td><td> TILL PhotoNICS </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Shutter </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrasjonsisolering Tabell </td><td> Minus k Technology </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Spesifikke reagenser </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Life Technologies </td><td> D-6923 </td><td> Spenningsfølsom fargestoff </td></tr><tr><td> Crym-EGFP Mouse linje </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> LAGER Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Sparsomt uttrykke EGFP i Layer 5 kortikale nevroner </td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices

Forstå biofysiske egenskaper og funksjonelle organisering av single nevroner og hvordan de behandler informasjon er grunnleggende for å forstå hvordan hjernen fungerer. Den primære funksjon av noen nervecelle er å behandle elektriske signaler, vanligvis fra flere kilder. Elektriske egenskaper av neuronal prosesser er usedvanlig kompleks, dynamisk, og, i det generelle tilfelle, er umulig å forutsi i fravær av detaljerte målinger. Å få en slik måling en ville, ideelt sett, liker å være i stand til å overvåke, på flere områder, terskelnivået hendelser som de reiser fra nettstedene til opprinnelsen på neuronal prosesser og summate på spesielle steder å påvirke handlingen potensielle innvielse. Dette målet har ikke blitt oppnådd i noen nevron grunn av tekniske begrensninger av målinger som benytter elektroder. For å overvinne denne ulempen, er det svært ønskelig å utfylle patch-elektroden tilnærming med avbildningsteknikker som tillater omfattende parallell Recordings fra alle deler av et nevron. Her beskriver vi en slik teknikk - optisk innspilling av membran potensielle transienter med organiske spenningssensitive fargestoffer (V m-imaging) - preget av sub-millisekund og sub-mikrometer oppløsning. Vår metode er basert på banebrytende arbeid på spenningssensitive molekylære prober 2. Mange aspekter av den opprinnelige teknologien har blitt kontinuerlig forbedret over flere tiår 3, 5, 11. I tillegg, tidligere arbeidserfaring dokumentert to essensielle egenskapene V m-bildebehandling. Først, fluorescens-signaler er lineært proporsjonal til membranpotensialet over hele fysiologiske området (-100 mV til +100 mV, 10, 14, 16). Det andre, lasting nerveceller med spenning-sensitive fargestoff som brukes her (JPW 3028) ikke har påviselige farmakologiske effekter. Den innspilte utvidelse av piggen under fargestoff lasting er fullstendig reversibel 4, 7. I tillegg viser eksperimentelle bevis for at det er mulig å fremskaffeet betydelig antall (opptil flere hundre) av opptak før påvisbare fototoksiske effekter 4, 6, 12, 13. I dag, tar vi fordel av det utmerkede lysstyrke og stabiliteten av et laser lyskilde på nær optimal bølgelengde for å maksimere følsomheten av V m-avbildningsteknikk. Den nåværende følsomhet tillater flere reiser optiske opptak av V m transienter fra alle deler av et nevron, inkludert axoner og axon collaterals, terminal dendrittiske grener, og individuelle dendrittiske spines. Relevant informasjon om signal interaksjoner kan analyseres kvantitativt samt direkte visualisert i form av en film.

Vellykket konfokalmikroskopi bør tillate klar identifikasjon av intakte neuronale prosesser som er nær overflaten av stykket og plassert i ett plan av fokus. Valget av nerveceller som er aktuelle for spenning imaging før spenningssensitive fargestoff lasting er kritisk. Et eksempel på confocal bilder av L5 pyramidale nevroner uttrykker EGFP i kortikale stykke (Crym transgen mus linje) er vist i figur 2. Axons av individuelle nevroner er klart synlig. Celler med lange intakte axoner (hvite piler) i e...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

En avbildningsteknikk for monitorering av membranpotensialet forandringer med sub-mikrometer romlig og sub-millisekund tidsoppløsning er beskrevet. Teknikken er basert på laser eksitasjon av spenningssensitive fargestoffer, kan målinger av signaler i axoner og axon collaterals, terminal dendritic grener og individuelle dendritic spines.

Spenning-sensitive Dye Opptak fra Axoner, dendritter og dendrittiske spines av enkelte nerveceller i hjernen skiver

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologisk analyse av Drosophila Larve perifer sensorisk Neuron dendritter og Axoner bruke Genetic Mosaikk

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Innspilling elektriske aktiviteten fra Identifiserte Nerveceller i Intakt Norgesmester Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendrittutløperne av Rat Primary hippocampus nevroner bruker Strukturert Illumination Mikros

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Akutt dissosiasjon av niøye Reticulospinal Axoner å Aktiver Opptak fra Release Face Membran av enkelte funksjons presynaptiske terminaler

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...