Name: exploring arterial smooth muscle kv7 potassium channel function using patch clamp electrophysiology and pressure myography
Uploaded: 2012-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av ett anslag från National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) till KLB och pre-doktorander stipendier från American Heart Association (09PRE2260209) och Arthur J. Schmitt stiftelsen BKM.

1. Kirurgisk excision av tunntarmen mesenterica Vaskulär Arcade <ol><li> Söva en 300-400 g Sprague-Dawley-råtta med isofluran (4%) administreras genom inhalation. </li><li> Utför en mittlinje laparotomi att exponera tunntarmen tarmkäxet. Exteriorize den lilla och stora tarmen genom buksnitt med stor omsorg för att undvika trauma till exponerade tarm och tarmkäx. Försiktigt lufta krös ut över steril gasbinda. </li><li> Kirurgiskt punktskatt tunntarmen och en del av tjocktarmen, inklusive blindtarmen (blodkär...

<ol>
	<li>Passmore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ/M+Currents+in+Sensory+Neurons:+Significance+for+Pain+Therapy.">KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy.</a> J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).</li><li>Falloon, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+small+artery+sensitivity+and+morphology+in+pressurized+and+wire-mounted+preparations.">Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).</li><li>Dunn, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+artery+sensitivity+to+agonists+under+isobaric+compared+with+isometric+conditions.">Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).</li><li>Buus, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sensitivity+of+rat+mesenteric+small+arteries+to+agonists+when+studied+as+ring+preparations+or+as+cannulated+preparations.">Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations.</a> Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).</li><li>Abdelhalim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+big+endothelin-1+in+comparison+with+endothelin-1+on+the+microvascular+blood+flow+velocity+and+diameter+of+rat+mesentery+in+vivo.">Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo.</a> Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).</li><li>Altura, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-response+relationships+for+arginine+vasopressin+and+synthetic+analogs+on+three+types+of+rat+blood+vessels:+possible+evidence+for+regional+differences+in+vasopressin+receptor+sites+within+a+mammal.">Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).</li><li>Henderson, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasopressin-induced+vasoconstriction:+two+concentration-dependent+signaling+pathways.">Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways.</a> J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).</li><li>Mackie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+KCNQ+potassium+channels+as+novel+targets+for+the+control+of+mesenteric+artery+constriction+by+vasopressin,+based+on+studies+in+single+cells,+pressurized+arteries,+and+in+vivo+measurements+of+mesenteric+vascular+resistance.">Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).</li><li>Brueggemann, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+selective+cyclooxygenase-2+inhibitors+on+vascular+smooth+muscle+ion+channels+may+account+for+differences+in+cardiovascular+risk+profiles.">Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles.</a> Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).</li><li>Brueggemann, L. I., Kaneez, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Technique. , (2012).</li><li>Berra-Romani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TTX-sensitive+voltage-gated+Na++channels+are+expressed+in+mesenteric+artery+smooth+muscle+cells.">TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).</li></ol>

De metoder och experimentella metoder som beskrivs här är ganska robusta och kan leda till tydliga och reproducerbara resultat när den tillämpas med stor omsorg om detaljerna. Bra elektrofysiologiska inspelningar och sammandragning / utvidgning av arteriella segment är beroende av hälsa celler och segment artär, respektive. Cellpreparationer kan variera från dag till dag, även med samma protokoll. Isolering lösningar kan användas i upp till 2 veckor, men om kvaliteten på cellpreparatet är låg på två påf...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> NATRIUMKLORID </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> Analysera Lösning: 145 Bad lösning för Elektrofysiologi *: 140 Intern lösning för elektrofysiologi: 10 Isolering lösning för myocyter *: 140 Bad lösning för tryck myography: 145 Lumen lösning för tryck myography: 145 </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> Analysera Lösning: 4,7 Bad lösning för Elektrofysiologi *: 5,36 Intern lösning för elektrofysiologi: 135 Isolering lösning för myocyter *: 5,36 Badlösning för tryck myography: 4,7 Lumen lösning för tryck myography: 4,7 </td></tr><tr><td> Kalium EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td> Intern lösning för elektrofysiologi: 0,05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H9136 </td><td> Bad lösning för Elektrofysiologi *: 10 Intern lösning för elektrofysiologi: 10 Isolering lösning för myocyter *: 10 </td></tr><tr><td> Dinatriumvätefosfat </td><td> Sigma </td><td> S5136 </td><td> Isolering lösning för myocyter *: 0,34 </td></tr><tr><td> Kaliumvätefosfat </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> Isolering lösning för myocyter *: 0,44 </td></tr><tr><td> Magnesiumklorid </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> Badlösning för Elektrofysiologi *: 1,2 Intern lösning för elektrofysiologi: 1 Isolering lösning för myocyter *: 1,2 </td></tr><tr><td> Kalciumklorid </td><td> Sigma </td><td&gt; C7902 </td><td> Bad lösning för Elektrofysiologi *: 2 Isolering lösning för myocyter *: 0,05 </td></tr><tr><td> Natriumfosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP331-1 </td><td> Analysera Lösning: 1,2 Badlösning för tryck myography: 1,2 Lumen lösning för tryck myography: 1,2 </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Analysera Lösning: 1,17 Badlösning för tryck myography: 1,17 Lumen lösning för tryck myography: 1,17 </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td> Analysera Lösning: 3 Bad lösning för tryck myography: 3 Lumen lösning för tryck myography: 3 </td></tr><tr><td> Pyrodruvsyra </td><td> Sigma </td><td> P4562 </td><td> Analysera Lösning: 2 Badlösning förtryck myography: 2 Lumen lösning för tryck myography: 2 </td></tr><tr><td> EDTA-dihydrat </td><td> Forskning Organics </td><td> 9572E </td><td> Analysera Lösning: 0,02 Badlösning för tryck myography: 0,02 Lumen lösning för tryck myography: 0,02 </td></tr><tr><td> D-glukos </td><td> Sigma </td><td> G7021 </td><td> Analysera Lösning: 5 Bad lösning för Elektrofysiologi *: 10 Intern lösning för elektrofysiologi: 20 Isolering lösning för myocyter *: 10 Bad lösning för tryck myography: 5 Lumen lösning för tryck myography: 5 </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td> Analysera Lösning: 1% Lumen lösning för tryck myography: 1% </td></tr><tr><td> pH </td><td></td><td></td><td> Analysera SolutioN: 7,4 Badlösning för Elektrofysiologi *: 7,3 Intern lösning för elektrofysiologi: 7,2 Isolering lösning för myocyter *: 7,2 Badlösning för tryck myography: 7,4 Lumen lösning för tryck myography: 7,4 </td></tr><tr><td> Osmolaritet </td><td></td><td></td><td> Analysera Lösning: 300 Bad lösning för Elektrofysiologi *: 298 Intern lösning för elektrofysiologi: 298 Isolering lösning för myocyter *: 298 Bad lösning för tryck myography: 300 Lumen lösning för tryck myography: 300 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 11 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 1. Komponenter i lösningar som används i experimentet. </td></tr></tbody></table>

exploring arterial smooth muscle kv7 potassium channel function using patch clamp electrophysiology and pressure myography

Sammandragning eller avslappning av glatta muskelceller i väggarna i motståndet artärer bestämmer artären diameter och därmed styr blodflödet genom kärlet och bidrar till det systemiska blodtrycket. Kontraktionen Processen regleras primärt av cytosolisk kalciumkoncentration ([Ca 2 +] CYT), som i sin tur styrs av en mängd olika jon transportörer och kanaler. Jonkanaler är vanliga mellanprodukter i signaltransduktionsvägar som aktiveras av vasoaktiva hormoner för att åstadkomma vasokonstriktion eller vasodilatation. Och jonkanaler ofta måltavla för läkemedel uppsåtligen (t.ex. kalciumkanalblockerare som används för att framkalla vasodilatation och lägre blodtryck) eller oavsiktligt (t.ex. för att framkalla oönskade kardiovaskulära biverkningar). KV7 (KCNQ) spänning-aktiverade kaliumkanaler har nyligen varit inblandad som viktiga fysiologiska och terapeutiska TargETS för reglering av kontraktion av glatt muskulatur. Att belysa specifika roller KV7 kanaler i både fysiologiska signaltransduktion och handlingar terapeutiska medel, måste vi studera hur deras aktivitet moduleras på cellnivå samt utvärdera deras bidrag i samband med den intakta artären. Råtta mesenteriska artärer ger en användbar modell-system. Artärerna kan lätt dissekeras, rengörs från bindväv, och användes för att framställa isolerade arteriella myocyter för patch-clamp-elektrofysiologi, eller kanyleras och trycksattes för mätning av kärlsammandragande / vasodilaterande svar under relativt fysiologiska betingelser. Här beskriver vi de metoder som används för båda typer av mätningar och ge några exempel på hur den experimentella designen kan integreras för att ge en bättre förståelse för de roller dessa jonkanaler i regleringen av vaskulär ton.

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography at JoVE.com

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Mätningar av KV7 (KCNQ) kalium kanal aktivitet i isolerade arteriella myocyter (med patch clamp elektrofysiologiska tekniker) parallellt med mätningar av constrictor / dilator svar (med tryck myography) kan avslöja viktig information om roller KV7 kanaler i vaskulär glatt muskulatur fysiologi och farmakologi.

Exploring arteriella glatta muskel KV7 Funktion kaliumkanal med Elektrofysiologi Patch Clamp och tryck Myography

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Metoder för Kapacitans Patch Clamp inspelningar från Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Registrering av jonkanaler Uttryckt i Xenopus oocyter

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Tryck-polering Pipetter för förbättrad patch-clamp-inspelning

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Övergående Påvisande i glatt muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolering av mänskliga Umbilical arteriella glatta muskelceller (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Jätte liposomberedningen för Imaging och Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Bedöma Murint Funktion Resistance Artery Använda Pressure Myography

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En-kanals Cell-ansluten Patch-clamp inspelning

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Mätning av Smooth muskelfunktion i isolerad vävnad Bath-ansökningar till farmakologi Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...