Name: ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a todos os membros de nosso laboratório para os seus conselhos, discussões e comentários úteis sobre o manuscrito. Gostaríamos também de agradecer particularmente Marta Koch e Bassem Hassan para a excelente sugestão que esperar até 1,5 horas APF antes de dissecar o cérebro para cultura em experimentos de remodelação. Agradecemos também a facilidade de imagem NHGRI para o uso de seu microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Neurociência Básica do Programa de Pesquisa Intramural NINDS, NIH (Z01 NS003106).

A. Preparação de Mídia <ol><li> Preparar meio completo pelo filtro esterilizante-Drosophila Schneider meio suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Os meios devem ser preparados de fresco de cada vez. Alternativamente, uma nova porção da pré-congelados meios de comunicação podem ser descongelado antes de cada utilização. </li><li> Antes da cultura, adicionam-se 10 ug / ml de insulina e 2 ecdisona ug / ml para os meios de comunicação. As drogas foram ...

<ol>
	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

<html> Crónicas manipulações genéticas da estrutura e função dos tecidos, incluindo mutações e expressão de transgenes, produzem tipicamente uma combinação de efeitos imediatos e tardios consequências indirectas que podem ser muito difíceis de separar. Complementando métodos genéticos com a farmacologia pode facilitar o interrogatório do curso de tempo atrás de um fenótipo. Por exemplo, esta tem sido uma poderosa abordagem para dissecar as contribuições dos diferentes componentes do citoesqueleto dura...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> Drosophila Schneider Mídia </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino (inactivado pelo calor) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdisona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 um </td></tr><tr><td> Olomoucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 um </td></tr><tr><td> Soro de cabra normal </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Cultura Millicell Insere celular </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 bem </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinça </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de Microscopia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Capa de vidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

Nós descrevemos um método para a cultura ex vivo de cérebros inteiros de Drosophila. Isto pode ser utilizado como um contraponto crónicas manipulações genéticas para investigar a biologia celular e desenvolvimento de estruturas cerebrais centrais, permitindo agudas intervenções farmacológicas e de imagiologia vivo de processos celulares. Como um exemplo da técnica, antes trabalhar a partir de nosso laboratório 1 demonstrou que um compartimento anteriormente não reconhecida subcelular situa-se entre os compartimentos axonais e somatodendritic de axónios do cérebro central Drosophila. O desenvolvimento deste compartimento, referido como o segmento de axónio inicial (AIS) 2, foi mostrado geneticamente depender da quinase neurónio específico dependente de ciclina, CDK5. Nós mostramos aqui que o tratamento ex vivo de cérebros de tipo selvagem de Drosophila larvais com a CDK5-farmacológico específico inibidores roscovitina e olomoucina 3 provoca alterações agudas em organização da actina, ena localização da proteína da superfície celular fasciclina 2, que imitam as alterações observadas nos mutantes que não possuem actividade CDK5 geneticamente. Um segundo exemplo da técnica de cultura ex vivo está prevista a remodelação das ligações do corpo de cogumelo embrionário (MB) neurônios gama durante a metamorfose de larva a adulto. O corpo de cogumelo é o centro da aprendizagem e memória olfativa na mosca 4, e esses neurônios gama podar os galhos axonais e dendríticas durante o desenvolvimento pupal e então re-ramos se estendem em um ponto no tempo mais tarde para estabelecer o padrão de inervação adulto 5. Poda destes neurónios do MB tem sido demonstrado que ocorrem através degeneração local de ramos neurites 6, por um mecanismo que é desencadeada por ecdisona, uma hormona esteróide, actuando no receptor de ecdisona B1 7, e que é dependente da actividade do ubiquitina-proteassoma sistema 6. O nosso método de cultura ex vivo pode be usado para interrogar ainda mais o mecanismo de remodelação de desenvolvimento. Descobrimos que na configuração de ex vivo cultura, os neurónios gama do MB recapitulou o processo de poda do desenvolvimento com um curso de tempo semelhante ao que in vivo. Era essencial, no entanto, de esperar até 1,5 horas após a formação pupário antes explantar o tecido para que as células de cometer irreversivelmente a metamorfose; dissecação dos animais no início da pupariation levou a metamorfose pouca ou nenhuma em cultura. Assim, com a modificação apropriada, a abordagem de cultura ex vivo pode ser aplicado para estudar dinâmica bem como os aspectos de estado estacionário da biologia cérebro central.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Este artigo descreve um método pelo qual se pode imitar<em&gt; In vivo</em&gt; Desenvolvimento do<em&gt; Drosophila</em&gt; Corpo cogumelo em uma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de cultura.

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurociência

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Preparation for Ex Vivo Color Fundus Photography

Preparation for Ex Vivo Color Fundus Photography  (Video) | JoVE 

Preparação para Fotografia Ex Vivo Color Fundus 

Understanding Motor Neuron Responses to Spinal Cord Stimulation

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the Cellular Responses of Motor Neurons Through Patch-Clamp Electrophysiology (Video) | JoVE

A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...