Name: ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Vi vill tacka alla medlemmar i vårt labb för sina råd, nyttiga diskussioner och kommentarer på manuskriptet. Vi vill också särskilt tacka Marta Koch och Bassem Hassan för det utmärkta förslaget att vi väntar tills 1,5 timmar APF innan dissekera hjärnor för odling i remodeling experiment. Vi tackar också NHGRI avbildning anläggning för användningen av deras konfokalmikroskop. Detta arbete stöddes av Basic Neuroscience Program för NINDS Interna Research Program, NIH (Z01 NS003106).

A. Beredning av medier <ol><li> Framställa komplett medium genom filtret-sterilisering Schneiders Drosophila-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin. </li><li> Media bör beredas på nytt varje gång. Alternativt kan en färsk alikvot av pre-frysta mediet tinas före varje användning. </li><li> Före odling, tillsätt 10 | ig / ml insulin och 2 | ig / ml ekdyson till mediet. Läkemedlen framställdes i form av koncentrerade lager och frystes i små alikvoter. Upptina...

<ol>
	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

<html> Kroniska genetiska manipulationer av vävnad struktur och funktion, inklusive mutationer och uttryck av transgener, vanligtvis producera en kombination av omedelbara effekter och sena indirekta konsekvenser som kan vara mycket svåra att separera. Komplettera genetiska metoder med farmakologi kan underlätta förhör av tidsförloppet bakom en fenotyp. Till exempel har detta varit en kraftfull strategi för dissekera bidrag från olika cytoskelettala komponenter under spermatogenes hos Drosophila 10....

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn Reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Slutkoncentration </td></tr><tr><td> Schneiders Drosophila Media </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum (värmeinaktiverat) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10 M-g/ml </td></tr><tr><td> Ekdyson </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roskovitin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> Olomoucin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> Normalt getserum </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell Cell Culture Inserts </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multiskål, 4 och </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176.740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 Tång </td><td> Fina Science Tools </td><td> 11.251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Objektglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Skyddsglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

Vi beskriver ett förfarande för ex vivo-odling av hela hjärnor Drosophila. Detta kan användas som en motvikt till kroniska genetiska manipulationer för att undersöka cellbiologi och utveckling av centrala hjärnstrukturer genom att akuta farmakologiska interventioner och levande avbildning av cellulära processer. Som ett exempel på den teknik, före arbeta från vårt laboratorium 1 har visat att en tidigare ej subcellulär avdelning ligger mellan de axonala och somatodendritiska fack axoner av Drosophila centrala hjärnan. Utvecklingen av denna kammare, benämnd axonet initiala segmentet (AIS) 2, visade genetiskt att bero på den nervcellsspecifika cyklinberoende kinas, CDK5. Vi visar här att ex vivo-behandling av vildtyp Drosophila larver hjärnor med CDK5-specifika farmakologiska hämmare roskovitin och olomoucin 3 orsakar akuta förändringar i aktin organisation, ochi lokalisering av det cellytebindande proteinet fasciclin 2, som efterliknar de förändringar som ses i mutanter som saknar aktivitet Cdk5 genetiskt. Ett andra exempel på ex vivo kulturen tekniken finns för ombyggnad av anslutningar av embryonal svamp kroppen (MB) gamma neuroner under metamorfos från larv till vuxen. Svamp kroppen är centrum för lukt inlärning och minne i gylfen 4, och dessa gamma nervceller beskära sina axonala och dendritiska grenar under puppa utveckling och sedan åter sträcker grenar vid ett senare tidpunkt för att fastställa den vuxna innervation mönstret 5. Beskärning av dessa neuroner i MB har visat sig ske via lokal nedbrytning av neurit grenar 6 genom en mekanism som utlöses av ekdyson, en steroid hormon som agerar på kommissionens ekdysonreceptor B1 7, och som är beroende av aktiviteten hos ubiquitin-proteasom-systemet 6. Vår metod för ex vivo odling kan bE som används för att förhöra ytterligare mekanism utvecklande ombyggnad. Vi fann att i ex vivo-odling inställning rekapitulerade gamma neuroner i MB processen för utvecklande beskärning med ett tidsförlopp liknande det som in vivo. Det var dock viktigt att vänta tills 1,5 timmar efter puparium bildandet före explantation vävnaden för att cellerna att begå irreversibelt till metamorfos, dissektion av djur i början av pupariation ledde till liten eller ingen metamorfos i kultur. Således, med lämplig modifiering kan ex vivo kulturen metod användas för att studera dynamiska och steady state aspekter av centrala hjärnan biologi.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Denna artikel beskriver en metod som man kan efterlikna<em&gt; In vivo</em&gt; Utveckling av<em&gt; Drosophila</em&gt; Svamp kropp i en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur system.

Ex vivo Odling av Hel, Utveckla Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo elektroporering av utvecklingsländer Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Elektroporation och Organotypic skiva kulturer av embryonala mus hjärnor för Live-Imaging av migrera GABAergic interneuroner

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalcium Imaging för att visualisera hjärnan Svaren till endokrin signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolisk analys av Drosophila melanogaster Larval och vuxna hjärnor

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Justering av optisk koherenstomografi i synligt ljus med konfokala bilder av samma musnäthinna

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Preparation for Ex Vivo Color Fundus Photography

Preparation for Ex Vivo Color Fundus Photography  (Video) | JoVE 

Förberedelse för Ex Vivo Color Fundus Photography 

Understanding Motor Neuron Responses to Spinal Cord Stimulation

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the Cellular Responses of Motor Neurons Through Patch-Clamp Electrophysiology (Video) | JoVE

Ex vivo-beredning av ryggmärgsskiva för helcellspatch-clamp-registrering i motorneuroner under ryggmärgsstimulering

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Kalciumavbildning för Drosophila-modell av epilepsi

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...