Name: progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00
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この研究は、米国立衛生研究所（NIH）、NINDSにおける学内研究プログラムによってサポートされていました。著者は、編集を手伝って顕微鏡とパメラCのふるいで助けるために分子医学と神経科学、リック·ドレイファスの研​​究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。

注：神経前駆細胞とoligodendrocytic系統細胞の培養ルーチンについては、インキュベーションを37℃で加湿した5％CO 2雰囲気で行った。 2日毎に、培地は、培養40〜70％コンフルエントであれば、新鮮な培地の50〜100％を使用して置き換えられます。近くコンフルエントの時点では、培養は通常、毎週のスケジュール上で2-2.5e6/T75フラスコで継代されています。 <p class="jove_tit...

<ol>
	<li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility.">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. 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Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li><li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve.">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li><li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia.">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li><li>Goldman, S. 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Res. 69, 966-975 (2002).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate.">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li><li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody.">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li></ol>

このプロトコルは、初代ヒト神経前駆細胞から胎児オリゴデンドロサイトを導出し、フローサイトメトリーと免疫蛍光染色の両方を使用して、その表現型を特徴付ける方法について説明します。胎児の中枢神経系から神経前駆細胞の拡大と成長は非常によく、1から4に記載されている。しかし、in vitro の実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイト...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12の1時01分</td><td>オメガ·サイエンティスト</td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td>ウシアルブミン</td><td>シグマ</td><td> A9418 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>質バイオ</td><td> 120-098-031 </td><td> 50μg/ mlの</td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>質バイオ</td><td> 118-084-061 </td><td> 2mMの</td></tr><tr><td> T3 </td><td>シグマ</td><td> T2877 </td><td> 3nMの</td></tr><tr><td> N2のコンポーネント</td><td> Gibco BRL社</td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 450から03 </td><td> 2 ng / mlの</td></tr><tr><td>しゃべるな</td><td> R＆Dのシステム</td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / mlの</td></tr><tr><td> bFGFの</td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> PDL </td><td>シグマ</td><td> P6407 </td><td> 50μgの/ mの</td></tr><tr><td> PFA </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15712 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>質バイオ</td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワージントン</td><td> LK003178 </td><td> 20 U / mlの</td></tr><tr><td> DNaseをバイアル</td><td>ワージントン</td><td> LK003172 </td><td> 0.005パーセント</td></tr><tr><td> EBSS </td><td>ワージントン</td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td>ゴールドを長引かせる ととも​​にDAPI </td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1試薬。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> プライマリABS（全1μg/ mlの時） </td><td></td><td> 種のアイソタイプ </td><td> ソース </td><td> 二次腹筋 </td></tr><tr><td colspan="5"> フローサイトメトリー </td></tr><tr><td> A2B5-ビオチン</td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ギフトJ.ニールソン</td><td>ストレプトアビジンPETR、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> O4FITC </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td> J.ニールソンからの贈り物</td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> O4 </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> GalC </td><td>マウス</td><td> IgGの3 </td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmIgGの3-PE、サザンバイオテック、アラバマ</td></tr><tr><td> MBP </td><td>チキン</td><td> IgYの</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> dαckIgYの-AMCA、ジャクソンIMMU。、ペンシルバニア</td></tr><tr><td>ネスチン</td><td>マウス</td><td> IgG 1の </td><td> Messam ら 2000 28 </td><td> gαmのIgG 1-PECy5、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> GFAP </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαrbたIgG-PEジャクソンIMMU、ペンシルバニア</td></tr><tr><td> βIIIチューブリン</td><td>マウス</td><td> IgGの2 </td><td> Covance、カリフォルニア州</td><td> gαmIgGの2のa-PETR、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td colspan="6"> 免疫細胞化学 </td></tr><tr><td> βIIIチューブリン （1:1,500） </td><td>マウス</td><td>のIgG 2A </td><td> Covance、カリフォルニア州</td><td> gαmのIgG 2A-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1:1,000） </td></tr><tr><td> GFAP （1:1,000） </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαrbのIgG-FITC、ジャクソンIMMU、ペンシルバニア （1:500） </td></tr><tr><td> MBP （1:50） </td><td>チキン</td><td> IgYの</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> dαckIgYの-FITC、ジャクソンIMMU、ペンシルバニア （1:100） </td></tr><tr><td> O4 （1:100） </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-AF546、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1：100） </td></tr><tr><td> GalC （1:10） </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-AF750、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1:100） </td></tr></tbody></table> 。フローサイトメトリーおよび免疫アッセイのために使用される表2抗体（腹筋） のconjugate抗体：PE、フィコエリトリン、PETR、フィコエリトリンテキサスレッド、AMCA、アミノメチルクマリン-アセテート; Cyは、シアニン、FITC、フルオレセインイソチオシアネートのIg：免疫グロブリン。 。AF：のAlexa Fluor;gαm：ヤギ抗マウス;gαrb：ヤギ抗ウサギ;dαck：ロバ抗ニワトリ。 </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

神経細胞とグリア細胞型へのヒト神経前駆細胞の分化は、神経細胞系譜開発の分子調節を研究し、比較するためのモデルを提供しています胎児の中枢神経系組織からの神経前駆細胞の in vitro での展開では 、十分に特徴付けされています。種々の培養条件の成人ヒト皮質下白質と開発からオリゴデンドロサイトを産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化に直接グリア前駆細胞の同定および単離にもかかわらず、in vitroの実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを獲得することは依然として困難である。ガラクトセレブロシドの分化+（GalC）及びO4 +神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト前駆体または前駆細胞（OPC）の妊娠中期胎児の脳を使用して報告されている。しかしながら、これらの細胞はアストロサイトとニューロンを含む支持細胞の非存在下で増殖しないし、文化の中で時間をかけて迅速に失われる。必要性は 、in vitro の実験で適したオリゴデンドロサイト系譜の細胞を産生する培養システムのために残してあります。 初代ヒトオリゴデンドロサイトの培養は、例えば、 生体内でそれらの細胞に感染し、ヒトポリオーマウイルス、JCVのような神経親和性感染因子の病因を研究するための有用なモデルである可能性があります。これらの培養細胞は、中枢神経系（CNS）の他の脱髄疾患のモデルを提供することができます。神経細胞（前駆細胞由来のニューロンは、PDN）とアストロサイトに分化する能力を維持しながら、プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性神経前駆細胞をin vitro で増殖（前駆細胞由来アストロサイト、PDA）、本研究では、神経前駆細胞を誘導できることを示していますoligodendrocytic系統の発展段階（前駆由来オリゴデンドロサイトは、PDO）の多くを介して区別することができます。 DMEM-F12無血清培地中で私たちの文化の神経前駆細胞はsup塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血小板由来増殖因子（PDGF-AA）、ソニックヘッジホッグ（Shh）、神経栄養因子（NT-3）、N-2とトリヨードサイロニン（T3）とで可能です。培養細胞は、およそ7日ごとに75センチメートルフラスコあたり2.5e6細胞で継代されています。これらの条件を用いて、培養中の細胞の大多数は少数のプロセスとそのようなA2B5およびO-4などの事前オリゴデンドロサイト細胞の急行マーカーによって特徴形態を維持。我々は4つの成長因子（GF）（bFGFは、PDGF-AA、Shhを、NT-3）を削除し、PDNからの馴化培地を追加すると、細胞は、GalCおよびミエリンなどのオリゴデンドロサイト分化の特定の複数のプロセスおよびエクスプレスマーカーを取得するために開始塩基性タンパク質（MBP）。我々は、オリゴデンドロサイトのユニークなマーカーを同定するために多色フローサイトメトリーを用いて表現型の特性評価を行った。

それは70％-80％コンフルエント神経前駆細胞培養（ 図1A）から分化プロセスを開始することが非常に重要です。多くの細胞は、それが特定の成長因子が含まれているため、前駆細胞からオリゴ培地に培地を変更した後に消えてしまうでしょう。これはoligodendrocytic表現型にコミットされていない神経前駆細胞の増殖は新しい媒体（ 図1B）によってサポートされないこと...

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Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖<em&gt; in vitroで</em&gt;ニューロンおよびアストロサイトに分化する能力を維持しています。この作品は、神経前駆細胞がselect増殖因子とコンディショニングによってoligodendrocytic系統の段階を経て分化誘導することができることを示しています。

ヒト胎児脳から由来オリゴデンドロサイト前駆細胞培養システム

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Measuring and Manipulating Functionally Specific Neural Pathways in the Human Motor System with Transcranial Magnetic Stimulation

経頭蓋磁気刺激によるヒト運動系における機能的特異的神経経路の測定と操作

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

共同培養実験のためのオリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト条件培地の生成

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...