Name: plaque assay for murine norovirus
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Wobus laboratorium for kritiske kommentarer og forslag. Arbejdet i laboratoriet af CEW blev finansieret af nystartede midler fra University of Michigan, en karriereudvikling tilskud fra NIH / NIAID Regional Center of Excellence for Bio-forsvar og Emerging Infectious Diseases Research (RCE) Program, Region V &#39;Great Søer &#39;RCE (NIH prisen 1-U54-AI-057.153) og NIH R01 AI080611. MBG-H. blev finansieret af Experimental Immunology (NIH T32 A1007413-16), og de molekylære mekanismer i Microbial Patogenese (NIH T32 A1007528) uddannelsesstipendier til University of Michigan. JBC blev finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (kapper), Brasilia, Brasilien.

1. Dyrkning af makrofagcellelinie RAW 264,7 <ol><li> Opretholde RAW 264.7-celler (ATCC, katalog # TIB-71) i DMEM-10 medie, som består af høj glucose DMEM med 10% (volumen / volumen) lavt endotoksin føtalt bovint serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin. Celler er typisk opretholdt i 175 cm2 vævskulturkolber indeholdende 35 ml medium pr kolbe og inkuberet ved 37 ° C og 5% CO2 i en vævsdyrkningsinkubator. Imidlertid kan enhver størrelse kolbe anvendes med en mængde, der er passende for størrelsen af ​​kolben. </li><li> At opdele celler: aspireres fra de gamle medier, der tilsættes 10 ml frisk DMEM-10 medier til cellerne, og derefter skrabe cellerne fra bunden af ​​kolben ved hjælp af en celleskraber. Derefter resuspenderes cellerne i en homogen opløsning ved at udarbejde celler i en 10 ml pipette og kraftigt presse cellerne gennem pipettespidsen pressed mod bunden af ​​kolben. Gentag denne handling mindst 3 gange så cellerne ikke længere klumper sig sammen. Kontrollere ved lysmikroskopi, at en enkelt cellesuspension blev genereret. Derefter overføre 1 ml (1:10 fortynding eller ~ 1x10 7-celler) - 2 ml (1:5 fortynding eller ~ 2x10 7-celler) af cellesuspensionen i en ny 175 cm2 kolbe, og bringe det endelige volumen af medier op til 35 ml. </li><li> Split-celler, når de er næsten sammenflydende (~ 1x10 8 celler total/175 cm2 kolber): hver tredje dag, hvis begyndende med en 1:10 fortynding, eller hver anden dag, hvis begyndende med en 1:05 fortynding. Anvender lysmikroskopi for at kontrollere cellemorfologi før dele celler. De fleste af cellerne skal se rund og ikke aktiveret. Aktiverede celler har granulat og / eller udvidet, ranglet morfologi med vedhæng. Lad ikke cellerne overgrow som disse celler typisk ikke danne plaques. Hold styr på passagen nummer og ofte starte forfra ved optøning af en lavere passage portion celler. (Vi bruger passage 30 som et cut-off). </li></ol> 2. Inficere RAW 264,7 celler med MNV Inoculum <ol><li> Seed RAW 264.7-celler i plader med 6 brønde (3,5 cm diameter) ved en densitet på 1x10 6 levedygtige celler / ml i DMEM-10 medier, og der tilsættes 2 ml af denne suspension til hver brønd. Det er vigtigt at fordele celler jævnt i brøndene enten ved at vippe plader med hånden mindst 10 gange eller ved hjælp af en vippende apparat til ~ 10 min. Ikke swirl pladerne, da dette vil bevirke, at cellerne klynge i centrum af brønden. Placere pladerne i en vævskulturinkubator (ved 37 ° C og 5% CO2). Tillade celler at vedhæfte natten over eller i mindst 4 timer ved 37 ° C. Celler bør være 60-80% konfluente til plakassay og jævnt fordelt i hele godt. </li><li> Den næste dag, forberede virusinokulum, som kan være fra MNV-inficerede celler i vævskultur eller fra homogeniserede væv eller fækale prøver af MNV-inficerede mus. Når du bruger vævsprøver, ært piExchange-klientudvidelser væv homogeniseres i 2 ml skruelåg rør indeholdende sterile silicaperler i 1 ml DMEM-10 under anvendelse af en vævshomogenisator (f.eks MagnaLyser, Roche). For fækale prøver, bør ikke mere end 3 fækalier homogeniseres i 1 ml medier. Alle prøver fryses derpå (ved -80 ° C) og optøet én gang før udførelse af plaque-assay. </li><li> Fremstilling af 10-fold fortyndinger af virusinokulum i komplet DMEM-5 medium, der består af DMEM / høj glucose, 5% (v / v) med lav endotoxin føtalt bovint serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin. </li><li> Ti-fold seriefortyndinger fremstilles på plader med 24 brønde: En repeater pipette anvendes til at dispensere 1,35 ml medium i flere brønde er 10 -1 fortynding fremstillet ved at blande 1,35 ml medie og 0,15 ml virus-holdige prøve, og derefter 0,15 ml af 10 -1 fortynding sættes til 1,35 ml af medier for at gøre 10 -2 dilution og så videre. Det er vigtigt at ændre tips hver gang du laver en ny fortynding. En multikanalpipette kan anvendes til fremstilling af fortyndinger af multiple prøver ad gangen med to spidser passer ind i en brønd i en 24-brønds plade overføre et samlet volumen på 0,15 ml per brønd (se figur 3A). </li><li> En typisk fortynding interval for vævshomogenater og fækale indhold er 10 -1 til 10 -3. Imidlertid plaques fra disse prøver har en tendens til at være mindre sammenlignet med dem fra vævskultur-prøver. I nogle tilfælde en 1:100 fortynding af fækale prøver er nødvendig for tilstrækkeligt fortyndet ud eventuelle toksiske komponenter i fæces, der kan forstyrre cellemonolaget, og hindrer således evnen til at tælle plaques. Den fortyndingsområde på vævskultur-lysater afhænger af den tid punkt af interesse i den virale livscyklus. Fortyndinger, der går op til 10 -9 kan være behov for på toppen af infektionen. </li><li> Efter de serielle fortyndinger fremstilles, mærkes den 6-brønds plades indeholder RAW 264,7 monolag (fra afsnit 2,1) med prøven navn og fortyndinger er belagt. En plade ad gangen, skal du fjerne alle medier ved at svirpe den ud eller udsugning det. Umiddelbart derefter tilsættes 0,5 ml af en fortyndet prøve til en brønd, så gentag med en dublet godt, før man går videre til næste fortynding. Når alle tre fortyndinger sættes til en plade, tilt plade frem og tilbage med hånden for at sikre, at alle celler er blevet dækket. Håndtere én plade ad gangen for at sikre, at cellerne ikke tørrer ud. </li><li> Efter tilsætning af 0,5 ml af fortyndingerne til hver brønd, stable pladerne oprejst og inkubere dem i 1 time ved stuetemperatur. Fordi volumenet tilsat til hver brønd er ikke tilstrækkelig til at dække monolaget fuldstændigt, pladerne skal forsigtigt vippes frem og tilbage ved håndkraft hver 10-15 min eller anbragt på en vippende apparat (~ 18 svingninger pr min). Dette forhindrer celler i at udtørre. </li></ol> 3. Agarose med lavt smeltepunkt (SeaPlaque) Overlay Preparation <ol><li> Beregning af overlay kræves til det samlede volumen af ​​plader før 1 times inkubation er fuldstændig. Den nødvendige volumen er 2 ml / brønd eller 12 ml/6-well plade. Forbered agarose (se afsnit 3,2) og medier (se afsnit 3,3) separat. </li><li> Til fremstilling af agarose, suspendere 3 g SeaPlaque agarose i et totalvolumen på 100 ml destilleret vand (3% vægt / volumen) i en glasflaske. Autoklavér i 20-30 min. (Hvis agarose allerede blev fremstillet før hånd, re-smeltende agarose i mikrobølgeovn.) Det er vigtigt at ækvilibrere SeaPlaque agarose til 42 ° C i et vandbad før brug, fordi hvis agarosen er for varmt, vil det dræbe cellerne. Sørg for vandstanden er lig med eller over niveauet af agarosen at undgå uønsket størkning. </li><li> Til fremstilling af de medier: at 100 ml 2x MEM-medium, som består af2x MEM, 10% (volumen / volumen) lavt endotoksin føtalt bovint serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 4 mM L-glutamin. Ækvilibrere medier til 37 ° C i et vandbad. </li><li> Bland både SeaPlaque agarose og 2 x MEM-medier sammen i en steril flaske ved et 1:1-forhold umiddelbart før overlejring af de inficerede cellemonolag. Hvis mere end 200 ml overlay er nødvendig, split volumen i flere flasker og holde i 37 ° C vandbad, indtil klar til brug. </li><li> Ved slutningen af ​​1 times inkubation (se afsnit 2.7), opsug inokulum ud af hver brønd. Langsomt tilsættes 2 ml topagar til kanten af ​​hver brønd ved at placere pipettespidsen mod væggen af ​​hver brønd. Op til 5 plader kan håndteres samtidigt uden celler udtørring. </li><li> Tillade overlejring at størkne i ca 10 minutter ved stuetemperatur før anbringelse plader oprejst i vævsdyrkningsinkubator. Pladerne inkuberes i 48 timer ved 37 ° C i 5% CO2. </li><li> Efterinkubationsperioden plaques er svagt synlig for det blotte øje, så Kontroller ufarvede plader for tilstedeværelsen af ​​plaques. Hvis ingen plaques er synlige, inkuberes i yderligere 4 timer og tjek igen. Imidlertid bør den maksimale inkuberingstid ikke overstige 72 timer. </li></ol> 4. Visualisering af plaques ved Neutral Red Staining <ol><li> At visualisere plaques, er den neutrale røde farvning opløsning fremstillet ved tilsætning af 3 ml neutral rød (0,33% vægt / volumen i DPBS, Sigma, katalog # N2889) til hver 97 ml 1 x PBS (vævskulturkvalitet, Mg2 + -, Ca 2 + - fri, Gibco, katalog nr. 10.010). Beregn mængden af ​​neutralt rødt farvningsopløsning nødvendigt for at eksperimentet: 12 ml neutral rød farvning opløsning kræves for hver 6-brønds plade. Derefter tilsættes 2 ml til hver brønd. Selv om nogle plakassay protokoller kræver agarose stikket skal fjernes fra brøndene, i denne protokol det neutrale rødfarvning opløsning sættes direkte på overlay. </li><li> Efter en time icubation ved 37 ° C, se, om plaques er synlige med neutral rød farvning opløsning stadig i brøndene. Hvis plakker ikke er umiddelbart indlysende, tillader farvning at fortsætte i yderligere time. Fortsæt inkubere indtil plaques er synlige. (Bemærk:. Farvning i mere end 3 timer er ikke optimal, og hvis der ikke plaques er synlige i den positive kontrolprøve efter 3 timer af farvning, har plaqueanalyse ikke korrekt) Efter farvningen er færdig, opsug neutral rød farvning opløsning og sikrer den agarose stikket ikke forstyrres, og derefter gå videre til at tælle plaques. </li><li> Tæl plaques ved at placere plade op og ned på en lyskasse og mærkning en prik på optalte plaques at undgå dublerede tæller. Vælg den fortynding at tælle plaques i brønde, hvor plaques er tydeligt adskilt (dvs ingen synlige tegn på plaques sammensmeltning). Hvis det er muligt, tæller plaques på to fortyndinger. Det er vigtigt at bemærke, at plaque størrelse kan variere mellem MNV stammer, virusinokulum og afhænger aftilstand RAW 264.7-celler i løbet af plaque-assay. </li><li> Hvis ingen plaques er synlige i en brønd, enten ikke var virus til stede i prøven eller mængden af ​​virus var under påvisningsgrænsen af ​​plaqueanalyse. I dette tilfælde plet brøndene rød med en lignende farve som andre plaque-holdige brønde. Alternativt fraværet af plaques også observeret, når der er for mange viruspartikler stede i en given fortynding. Dette fører til lysis af hele monolaget og brønde synes orange / gul. </li><li> Beregn virale titere. Tilsæt antal plaques i både brønde i en enkelt fortynding og multiplicere med fortyndingsfaktoren (dvs. 1 ml, hvis to brønde inficeres med 0,5 ml). Dette vil give mængden af ​​plaquedannende enheder (PFU) i inokulum på 1 ml. For eksempel i figur 4 ved 10 -2 fortynding én brønd (mærket &quot;II&quot;) har 14 plaques og den anden brønd (mærket med &quot;V&quot;) har 17 plaques. Således vil den virale titer være 14x10 2 + 17x10 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Repræsentative resultater Infektiøse MNV-1-partikler kan kvantificeres ved anvendelse af en plaqueanalyse som beskrevet skematisk i fig. 1. Figur 2A viser en brønd med et monolag af RAW 264.7-celler lige inden infektion, mens figur 2B viser tre synlige plaks angivet med romertal I, II og III i en brønd. Enkelte trin i assayet er vist i figurerne 3A til F. Figur 3A viser fremstillingen af 10-fold fortyndingsrække af en virus-holdige prøve. Figur 3B viser overførslen af fortyndinger til dobbelte brønde i en 6-brønds plade. Fig 3C viser den vippende apparat anvendt til at inkubere RAW 264.7-celler med inokulum ved stuetemperatur i 1 time Figur 3D viser celler belægningen med SeaPlaque:. MEMBlandingen. Figur 3E viser en plade ved stuetemperatur for at tillade overlay at størkne, mens Figur 3F viser celler blev farvet med en 0,01% neutral rød opløsning 48 timer senere. Efter farvning af celler i 1-3 timer og opsugning af neutral rød farvning opløsning, er plaques synlige og kan tælles (figur 4). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Fig. 1. Skematisk af MNV plaque assayprotokollen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figur 2. Repræsentative billeder af en brønd i et monolag før infektion og efter dannelsen af plaques. A) RAW 264.7-celler blev dyrket natten over og afbildes under et lysmikroskop ved 20x forstørrelse. B) Celler blev farvet med 0,01% neutral rød opløsning efter 48 hr for infektion og visualiseres under et lysmikroskop ved 4x forstørrelse. Romertal I, II og III viser tre synlige plaks. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figur 3. Repræsentative billeder af de forskellige plaque-assay trin. A) MNV-1 inoculum fremstilles i 10 gange fortyndinger. B) Inoculum sættes til cellemonolag i to fordybninger. C) Celler og inokulum inkuberes ved at rokke i 1 time ved stuetemperatur. D) Celler belagt med en 1:1 blanding af SeaPlaque agarose og 2x MEM-medium. E) Pladerne inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur for at tillade overlejringen at størkne. F) farvning af celler med neutralrødt farvningsopløsningen 48 timer efter infektion. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figur 4. MNV-1 danner plaques i celle monolayers. Vist her er en repræsentativ plaque-assay pladen 48 timer efter infektion, viste plaques farvet med neutral rød farvning opløsning efter 1 timers inkubation. Pladen viser dobbelte brønde i tre 10-folds fortyndinger. Brønde mærket med romertal I og IV svarer til 10-1 fortynding, II og V svarer til 10-2 fortynding, III og VI svarer til 10-3 fortynding. Den virale titer af prøven er angivet nedenfor (se punkt 4,5 for detaljerne for beregningen).

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Plaque assay fremgangsmåde til MNV-1 præsenteret her er en måde at kvantificere infektiøse MNV partikler. Ved at følge analysetrin illustreret i figur 3, kan man opnå reproducerbare virale titere. Detektionsgrænsen for assayet afhænger af udgangsmaterialet anvendte fortynding. Ved start med en 1:10 fortynding af prøven, som beskrevet ovenfor, detektionsgrænsen af plaqueanalyse er 10 pfu (dvs., 1 plaque er synlig ved 10 -1 fortynding). Da hver plaque repræsenterer en enkelt virus kan plaqueanalyse også anvendes til at oprense klonale populationer af MNV ved at udvælge isolerede plaques og plantemateriale dem som beskrevet tidligere 1. Desuden kan plakoprensninger også anvendes til at adskille en individuel viruspopulationen fra blandede viruspopulationer. En begrænsning ved anvendelse af et plaque-assay til påvisning af MNV infektion er, at ikke alle MNV stammer danne plaques 4. Det kan imidlertid være muligt at overvinde inability af nogle MNV-stammer, isoleret fra dyr, til dannelse af plaks ved serievis passage disse virus i vævskultur 7. Et alternativ til plaqueanalyse er at måle infektiøse partikler via TCID50 teknikken 3, 4. Dette assay kvantificerer mængden af virus krævet for at producere CPE i 50% af inokulerede vævskulturceller efter endpoint fortyndinger og tager en uge at fuldføre for MNV 4. Ud over at være langsommere end en plaque-assay er TCID50-assayet endvidere ikke så følsomme (detektionsgrænse = 200 TCID50 / ml) på grund af toksiciteten af vævsprøver til RAW 264.7-celler fire. Selvom kritiske skridt i protokollen er blevet beskrevet i hele protokollen følgende afsnit indeholder et resumé for at lette fejlfinding. Det mest kritiske trin i protokollen er at sikre, RAW 264.7-celler forbliver levedygtige hele assayet til at understøtte virusreplikation. Dette kanovervåges på hvert trin af assayet via lysmikroskopi. Cellelevedygtighed sikres på to måder. Først skal man være opmærksom på ikke at lade cellerne tørre ud, mens håndtering af plader. Således er pladerne inokuleret én ad gangen, rystet under infektionen tidsrum, og skal forblive lukket, når de ikke håndteres. For det andet, løsninger tilføjet på celler skal afbalanceres til ~ 37 ° C. Desuden er det afgørende for den generelle sundhed i RAW 264,7 celler til at opretholde dem i medier indeholdende lav endotoxin serum (&lt;10 EU / ml), hvilket begrænser aktivering af celler. Derudover har vi observeret en højere fejlrate af plaqueanalyse ved anvendelse af celler fra passage 30 eller højere. Selv om dette sandsynligvis vil variere fra laboratorium til laboratorium, er det vigtigt at inkludere en positiv kontrol (fx en prøve med en kendt viral titer) for at sikre reproducerbare titere, navnlig når der anvendes højere passage RAW 264.7-celler. For at begrænse anvendelse af højere passage-celler, er det tilrådeligt at fastfryse hætteglas med tidlig Passage celler efter modtagelsen af ​​RAW 264,7 celler og starte en ny kultur fra de frosne hætteglas ofte. Start forfra med lavpassage cellekulturer vil også være nyttigt, når cellerne udviser ændrede egenskaber, såsom manglende overholdelse af, ændringer i cellemorfologi (fx fra runde til ranglet og sprede ud), eller når forurening med mycoplasma er blevet opdaget. Et andet vigtigt punkt at være opmærksom på er at sikre, at pipettespidserne skiftes mellem prøverne og i fortyndinger. Dette vil sikre nøjagtige seriefortyndinger og forhindre krydskontaminering mellem prøverne. Den ene trin i protokollen, hvor samme pipettespidsen kan bruges igen, er, når seriefortyndinger af den samme prøve sættes til brøndene. I så fald bør man starte fra den mest fortyndede inokulum til den mindste, og energisk pipetteres op og ned i forbindelse med udarbejdelsen af ​​en ny fortynding. Plaque assayprotokollen kan ændres for flere modifikationer. Én modifikation, der kan foretages, når tHer er ikke nok celler til inokulering brønde in duplo, er at inokulere kun en enkelt brønd for hver fortynding. Eftersom inoculum volumen er 0,5 ml, antallet af plaques derefter skal multipliceres med en faktor på 2 omsætter til pfu / ml. Plak-assayet kan også tilpasses til anvendelse med andre adhærerende cellelinje der er i stand til at understøtte replikation af MNV, og dette er blevet beskrevet for det murine microglial BV-2 cellelinien 8. Andre modifikationer, som kan gennemføres, er tilpasninger, der er blevet beskrevet til plaqueanalyse protokoller udviklet for andre vira. Ved MNV er følgende modifikationer allerede gennemført med held, anvendelsen af methylcellulose i stedet for Sea Plaque agarose 9, og farvning af cellerne med krystalviolet eller methylenblåt i stedet for neutralt rødt 10, 11. Generelt kan denne protokol nemt tilpasses efter behov for at kvantificere andre plakdannende vira eller anvendes til othøh virus, der forårsager lytiske infektioner i RAW 264,7 celler, hvilket gør det til et nyttigt redskab til at kvantificere infektiøse viruspartikler i almindelighed.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM / Høj glucose </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11.935 </td></tr><tr><td> 100x penicillin og streptomycin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM ikke-essentielle aminosyrer </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50.100 </td></tr><tr><td> Neutral Red 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10.010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirconia / silicaperler </td><td> Biospec Products </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Model 35 Speed ​​Rocker </td><td> LABNET </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lyser Instrument </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> RAW 264.7-cellelinie </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Vævsdyrkningsinkubator </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Murin norovirus (MNV) er det eneste medlem af norovirus slægten, der effektivt vokser i vævskultur 1, 2. Cellelyse og cytopatisk virkning (CPE), i løbet af MNV-1-infektion af murine dendritiske celler eller makrofager 1. Denne egenskab ved MNV-1 kan anvendes til at kvantificere antallet af infektiøse partikler i en given prøve ved at udføre en plakassay 1. Plak-assayet er baseret på evnen hos MNV-1 for at lysere cellerne og til dannelse af huller i et sammenflydende cellemonolag, der kaldes plaques 3. Flere teknikker kan anvendes til påvisning af virusinfektioner i vævskultur, høstet væv, kliniske og miljømæssige prøver, men ikke alle måle antallet af infektiøse partikler (f.eks qRT-PCR). En måde at kvantificere infektiøse viruspartikler er at udføre en plakassay 3, som vil blive beskrevet detaljeret nedenfor. En variant af MNV plakassay er fluorescent fokus assay, hvor MNV antigen immunfarvet i cellemonolag 4. Dette assay kan være hurtigere, da viral antigenekspression forud plakdannelse. Det er også nyttigt til titrering vira ikke kan danne plaques. Men det fluorescerende fokus assayet kræver flere midler ud over dem af plaque-assay, såsom antistoffer og et mikroskop for at tælle fokus-dannende enheder. Infektiøs MNV kan også kvantificeres ved at bestemme den 50% Tissue Culture infektiøs dosis (TCID50) 3. Denne analyse måler mængden af virus krævet for at producere CPE i 50% af inokulerede vævskulturceller ved endpoint titrering 5. Men dens detektionsgrænse er højere end i en plaqueanalyse 4. I denne artikel beskriver vi en plaqueanalyse protokol der kan anvendes til effektivt at bestemme antallet af infektiøse MNV partikler er til stede i biologiske eller miljømæssige prøverne 1, 4, 6. Denne metode er based om forberedelsen af ​​10 gange serielle fortyndinger af MNV-holdige prøver, som anvendes til podning af et monolag af tolerante celler (RAW 264.7 murine makrofager celler). Virus får lov at binde sig til cellemonolaget i en bestemt tidsperiode og derefter suget før tildækning celler med en blanding af agarose og celledyrkningsmedier. Agaren muliggør spredning af virale afkom til naboceller og samtidig begrænse spredning til fjernt beliggende celler. Følgelig er inficerede celler lyseres og danner huller i monolag kendt som plaques. Ved tilstrækkelig spredning af virus, bliver plaques synlige efter farvning af celler med farvestoffer, såsom neutral rød, methylenblåt eller krystalviolet. Ved lave fortyndinger, stammer hver plak fra en infektiøs viruspartikel og dets afkom, som bredte sig til naboceller. Således, at tælle antallet af plaques gør det muligt at beregne plaque-dannende enheder (PFU) til stede i den ufortyndede prøve 3.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at kvantificere infektiøse partikler af murin norovirus (MNV), som er den eneste norovirus, som effektivt replikerer i cellekultur. Plak-assayet udnytter MNV s tropisme for murine makrofager og kan tilpasses til anvendelse med biologiske eller miljømæssige prøver indeholdende MNV.

Plaque Assay for murin Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Koncentration beslutsomhed gennem plakanalyser: ved hjælp af traditionel og Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En murin model af gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling metode til påvisning af menneskelige Norovirus på overflader

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolær Lavage af murine Lunger at analysere inflammatorisk celleinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...