Name: plaque assay for murine norovirus
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Wobus laboratorium for kritiske kommentarer og forslag. Arbeid i laboratoriet av CEW ble finansiert av oppstart midler fra University of Michigan, en karriereutvikling stipend fra NIH / NIAID Regional Center of Excellence for Bio-forsvaret og Emerging Infectious Diseases Research (RCE) Program, Region V &quot;Store innsjøer &quot;RCE (NIH award 1-U54-AI-057153) og NIH R01 AI080611. MBG-H. ble finansiert av Experimental Immunology (NIH T32 A1007413-16) og de molekylære mekanismene i Microbial Patogenese (NIH T32 A1007528) opplæring tilskudd til Universitetet i Michigan. JBC ble finansiert av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (kapper), Brasilia, Brasil.

1. Dyrking av Macrophage cellelinje RAW 264,7 <ol><li> Oppretthold RAW 264,7 celler (ATCC, katalog # TIB-71) i DMEM-10 medium, som består av høy glukose DMEM med 10% (v / v) med lav endotoksin føtalt bovint serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 1 mm ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin. Celler blir typisk opprettholdt i 175 cm 2 vevskultur kolber inneholdende 35 ml medium per kolbe og inkubert ved 37 ° C og 5% CO 2 i en vevskultur inkubator. Imidlertid kan en hvilken som helst størrelse kolbe brukes med et volum av middel som er passende for størrelsen av kolben. </li><li> Vil dele celler: aspirer av gamle mediet, tilsettes 10 ml av frisk DMEM-10 mediet til cellene, og deretter skrape cellene fra bunnen av kolben ved hjelp av en celle skrape. Neste, resuspender cellene i en homogen løsning ved å tegne opp celler i en 10 ml pipette og kraftig klemme cellene gjennom pipettespissen pressed mot bunnen av kolben. Gjenta denne handlingen minst 3 ganger så cellene ikke lenger klumpe seg sammen. Kontroller ved lysmikroskopi at en enkelt cellesuspensjon ble generert. Deretter overføre 1 ml (1:10 fortynning eller ~ 1x10 7 celler) - 2 ml (1:5 fortynning eller ~ 2x10 7 celler) av cellesuspensjonen i et nytt 175 cm 2 kolbe, og bringe det endelige volum av mediet opp til 35 ml. </li><li> Split celler når de er nesten konfluent (~ 1x10 8 celler total/175 cm 2 flasker): hver tredje dag hvis du starter med en 1:10 fortynning, eller annenhver dag hvis du starter med en 1:5 fortynning. Bruk lysmikroskopi å sjekke cellemorfologi før splitting celler. De fleste av cellene skal se runde og ikke aktivert. Aktiverte celler har granulater og / eller utvidet, spindly morfologi med vedheng. Ikke la cellene overgrow som disse cellene vanligvis ikke danner plakk. Hold orden på passasjen nummer og ofte begynne på nytt ved tining en lavere passasje delmengde av celler. (Vi bruker passasje 30 som en cut-off). </li></ol> 2. Infisere RAW 264,7 Celler med MNV Inoculum <ol><li> Seed RAW 264,7 celler i 6-brønners plater (3,5 cm diameter) ved en densitet på 1x10 6 levedyktige celler / ml i DMEM-10 medium, og tilsett 2 ml av denne suspensjon til hver brønn. Det er viktig å fordele cellene jevnt i brønner enten ved rocking platene for hånd minst 10 ganger eller ved å bruke en anordning for vuggende ~ 10 min. Ikke virvel platene da dette vil føre til at cellene til klynge i sentrum av brønnen. Place platene i en vevskultur inkubator (ved 37 ° C og 5% CO 2). Tillate celler å feste over natten eller i minst 4 timer ved 37 ° C. Celler bør være 60 - 80% konfluent for plakett analysen og fordelt jevnt i hele brønnen. </li><li> Neste dag, forberede viruset inokulum, som kan være fra MNV-infiserte celler i vevskultur eller fra homogeniserte vev eller fecal prøver av MNV-infiserte mus. Når du bruker vevsprøver, pea-sized pieces vev homogeniseres i 2 ml skrukork rør inneholdende sterile silika perler i 1 ml DMEM-10 ved hjelp av en vev homogenisator (f.eks MagnaLyser; Roche). For fecal prøver, bør ikke mer enn 3 fecal pellets homogeniseres i en ml media. Alle prøver blir deretter frosset (ved -80 ° C) og tint en gang før utfører plakk analysen. </li><li> Forbered 10-fold fortynninger av viruset inokulum i fullstendig DMEM-5 medium, som består av DMEM / Høy glukose, 5% (v / v) med lav endotoksin føtalt bovint serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 1 mm ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin. </li><li> Ti ganger seriefortynninger blir fremstilt i 24-brønners plater: En repeater pipette brukes å dispensere 1,35 ml medier i flere brønner, kan 10 -1 fortynning laget ved å blande 1,35 ml av media og 0,15 ml av virus-inneholdende prøve, og hvorpå 0,15 ml av 10 -1 fortynning tilsettes til 1,35 ml av media for å gjøre 10 -2 dilution og så videre. Det er viktig å endre tips hver gang du gjør en ny fortynning. En flerkanals pipette kan brukes til å lage de fortynninger av flere prøver om gangen med to spisser passer inn en brønn i en 24-brønns plate overfører et totalvolum på 0,15 ml per brønn (se figur 3A). </li><li> En typisk fortynning utvalg for vev homogenater og fecal innhold er 10 -1 til 10 -3. Imidlertid plaketter fra disse eksemplene tendens til å være mindre i forhold til de fra vevskultur prøver. Videre, i noen tilfeller en 1:100 fortynning av fecal prøvene trengs for å tilstrekkelig utvanne ut noen giftige komponenter i feces som kan forstyrre cellens monolayer dermed hindrer muligheten til å telle plakk. Fortynningen rekke vevskultur lysater avhenger av tiden severdighet løpet viral livssyklus. Fortynninger som går opp til 10 -9 kan være nødvendig på toppen av infeksjon. </li><li> Etter seriefortynninger er forberedt, merke 6-brønners plates inneholder RAW 264,7 monolayers (fra pkt. 2.1) med prøven navn og fortynninger blir belagt. En plate av gangen, fjerne alle medier ved å dra den ut eller aspirere det. Umiddelbart etterpå tilsett 0,5 ml av en fortynnet prøve til en brønn, og gjenta med et duplikat godt, før du går videre til neste fortynning. Når alle tre fortynninger blir lagt i en plate, tilt plate og tilbake for hånd for å sikre at alle cellene er blitt dekket. Håndtak en plate på et tidspunkt for å sikre at cellene ikke tørker ut. </li><li> Etter tilsetning av 0,5 ml av fortynningene til hver brønn, stable platene oppreist og inkuber dem i 1 time ved romtemperatur. Fordi volumet tilsatt til hver brønn er ikke tilstrekkelig til å dekke monolaget helt, platene må forsiktig tiltet og tilbake for hånd hvert 10-15 minutt eller plassert på en gyngende apparat (~ 18 oscillasjoner pr min). Dette hindrer cellene fra å tørke ut. </li></ol> 3. Lavt smeltepunkt Agarose (SeaPlaque) Overlay Forberedelse <ol><li> Beregne mengden overlegget for det totale volum av platene før 1 timers inkubasjon er fullført. Volumet trengs er 2 ml / brønn eller 12 ml/6-well plate. Forbered agarose (se pkt. 3.2) og media (se kapittel 3.3) separat. </li><li> For å forberede agarosen, suspendere 3 g SeaPlaque agarose i et totalt volum av 100 ml destillert vann (3% w / v) i en glassflaske. Autoklaveres for 20-30 min. (Hvis agarose var allerede forberedt før hånd, re-smelte agarose i mikrobølgeovn.) Det er viktig å ekvilibrere SeaPlaque agarose til 42 ° C i et vannbad før bruk fordi hvis agarosen er for varmt, vil det drepe cellene. Kontroller vannivå er lik eller over nivået for agarose for å unngå uønsket størkning. </li><li> For å fremstille mediene: gjør 100 ml 2x MEM medier, som består av2x MEM, 10% (v / v) med lav endotoksin føtalt bovint serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 4 mM L-glutamin. Ekvilibrere medier til 37 ° C i et vannbad. </li><li> Bland både SeaPlaque agarose og 2x MEM media sammen i et sterilt flaske i forholdet 1:1 umiddelbart før overliggende den infiserte cellen monolayers. Hvis mer enn 200 ml overlegg er nødvendig, delt volum i flere flasker og holde i 37 ° C vannbad til den er klar til bruk. </li><li> På slutten av den 1 timers inkubasjon (se pkt. 2.7), aspirer inokulatet av av hver brønn. Tilsett sakte 2 ml overlegget til kanten av hver brønn ved å plassere pipettespissen mot veggen av hver brønn. Opp til 5 plater kan håndteres samtidig uten celler tørker ut. </li><li> La overlegg å stivne i ca 10 min ved romtemperatur før du legger platene stående i vevet kulturinkubatoren. Inkuber plater for 48 timer ved 37 ° C i 5% CO 2. </li><li> Etterinkubasjonstiden, plakk er svakt synlig for det blotte øye, så sjekk unstained plater for tilstedeværelse av plakk. Hvis ingen plaques er synlige, inkuberes i ytterligere 4 timer og sjekk igjen. Imidlertid bør den maksimale inkubasjonstid ikke overstige 72 timer. </li></ol> 4. Visualisering av plakk ved Neutral Red Farging <ol><li> For å visualisere plakk, er den nøytrale røde flekker løsning fremstilt ved å tilsette 3 ml av nøytral rød (0,33% w / v i DPBS; Sigma, katalog # N2889) til hver 97 ml 1x PBS (vevkultur klasse, 2 Mg + -, Ca 2 + - gratis, Gibco, katalog # 10010). Beregn volumet av nøytral rød farging løsning nødvendig for forsøket: 12 ml nøytral rød farging løsning kreves for hver 6-brønns plate. Deretter legger 2 ml til hver brønn. Selv om noen plakk assay protokoller krever agarosen pluggen skal fjernes fra brønnene, i denne protokollen den nøytrale røde farging oppløsning tilsettes direkte på overlegget. </li><li> Etter en en time icubation ved 37 ° C, sjekk om plakk er synlige med nøytral rød flekker løsning fortsatt i brønner. Hvis plakk ikke er lett synlig, la farging å fortsette i en annen hr. Fortsett inkubering til plakk er synlige. (Merk:. Farging for mer enn 3 timer er ikke optimal, og hvis ingen plakk er synlige i den positive kontrollutvalget etter 3 timers av flekker, gjorde plakett analysen ikke fungere riktig) Etter farging er fullført, suge nøytral rød flekker løsning , som sikrer agarose pluggen er ikke forstyrret, og deretter fortsette å telle plakk. </li><li> Tell plakk ved å plassere plate opp ned på en lyskasse og markerer en prikk på telles plaketter for å unngå dupliserte tellinger. Velg fortynningen å telle plakk i brønner der plakk er tydelig atskilt (dvs. ingen visuelle bevis av plakk fusing sammen). Hvis det er mulig, telle plaketter på to fortynninger. Det er viktig å merke seg at plakk størrelse kan variere mellom MNV stammer, virus inokulum, og avhengertilstand RAW 264,7 celler under plakett analysen. </li><li> Hvis ingen plakk er synlige i en brønn, enten det var ingen virus tilstede i prøven eller mengden av virus var under deteksjonsgrensen av plakket analysen. I dette tilfellet, brønnene flekken rød med en lignende farge som andre plakk-holdige brønner. Alternativt, er fraværet av plakk også observert når det er for mange viruspartikler som foreligger i en gitt fortynning. Dette fører til lysis av hele monolaget og brønner være oransje / gult i fargen. </li><li> Beregn viral titere. Legg til antall plakk både brønner på et enkelt fortynning og multiplisere med fortynningsfaktoren (dvs. 1 ml hvis 2 brønner er infisert med 0,5 ml). Dette vil gi mengden av plakk dannende enheter (PFU) i inokulum på 1 ml. For eksempel, i figur 4 ved 10 -2 fortynning, har en brønn (merket &quot;II&quot;) 14 plakk og den andre brønn (merket &quot;V&quot;) har 17 plakk. Således, vil den viral titer være 14x10 2 + 17x10 2 = 3,100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Representant Resultater Infeksiøse MNV-1 partikler kan kvantifiseres ved hjelp av en plakett analysen som skissert skjematisk i figur 1. Figur 2A viser en brønn med et monosjikt av RAW 264,7 celler bare før infeksjon, mens figur 2B viser tre synlige plakk indikert av romertall I, II og III i en brønn. Enkelte trinn av analysen er avbildet i figurene 3A til og med F. Figur 3A viser fremstillingen av 10-gangers fortynning serie av et virus-holdig prøve. Figur 3B viser overføring av fortynninger til duplikatbrønner av en 6-brønns plate. Figur 3C viser den vippende apparat som brukes til å inkubere RAW 264,7 celler med inokulum ved romtemperatur i 1 time Figur 3D viser celler blir kledde med SeaPlaque:. MEMblanding. Fig. 3E viser en plate ved romtemperatur for å tillate overlay-å stivne, mens figur 3F viser celler blir farget med en 0,01% nøytral rød oppløsning 48 hr senere. Etter farging celler for 1-3 hr og aspirering av nøytral rød farging løsning, plakk er synlige og kan telles (figur 4). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk av MNV plakk analyseprotokollen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figur 2. Representative bilder av en brønn av en monolag før infeksjon og etter dannelsen av plakk. A) RAW 264,7 celler ble dyrket over natten og avbildes under et lysmikroskop ved 20x forstørrelse. B) Celler ble farget med en 0,01% nøytral rød oppløsning etter 48 hr av infeksjon og visualisert under et lysmikroskop ved 4x forstørrelse. Roman nummer I, II, og III viser tre synlige plakk. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figur 3. Representative bilder av de forskjellige plakk analysegrenser trinn. A) MNV-1 podestoff er utarbeidet i 10-fold fortynninger. B) Inoculum legges til celle monolayers i duplikatbrønner. C) Celler og inokulum inkuberes med rocking i 1 time ved romtemperatur. D) Celler kledde med en 1:1 blanding av SeaPlaque agarose og 2x MEM media. E) Platene inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur for å tillate overlay-å stivne. F) farging av celler med nøytral rød farging løsning 48 hr etter infeksjon. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figur 4. MNV-1 former plakk i celle monolAyers. Vist her er en representativ plakett assay plate 48 hr etter infeksjon, viser plakk farget med nøytral rød farging løsning etter 1 hr av inkubasjon. Platen viser duplikatbrønner av tre 10-fold fortynninger. Brønner merket med romertall I og IV svarer til 10-1 fortynning, II og V tilsvarer 10-2 fortynning; III og VI tilsvarer 10-3 fortynning. Viral titer av prøven er angitt nedenfor (se avsnitt 4.5 for detaljene i beregningen).

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Plakett analysemetode for MNV-1 presenteres her er en måte å synliggjøre smittsomme MNV partikler. Ved å følge analyseresultatene trinnene illustrert i figur 3, kan en oppnå reproduserbare virale titere. Påvisningsgrensen til analysen avhenger av startvisningen fortynning brukt. Når man starter med en 1:10 fortynning av prøven som beskrevet ovenfor, er grensen for deteksjon av plakket analysen 10 PFU (dvs. en plakk synlig på 10 -1 fortynning). Siden hver plakk representerer en enkelt virus, kan plakett analysen også brukes til å rense klonale bestander av MNV ved å plukke isolerte plakk og spre dem som beskrevet tidligere 1. I tillegg kan plakk renselser også brukes til å separere et individuelt viruspopulasjonen fra blandede virus populasjoner. En begrensning av bruk en plakett assay for påvisning av MNV infeksjon er at ikke alle MNV stammer danne plakk 4. Imidlertid kan det være mulig å overvinne inability til noen MNV stammer, isolert fra dyr, for å danne plakk ved serielt passaging disse virusene i vevskultur 7. Et alternativ til plakk-analysen er å måle infeksiøse partikler via TCID 50 teknikken 3, 4. Denne analysen tallfester hvor mye virus som kreves for å produsere CPE i 50% av inokulerte vev kultur celler etter endepunktet fortynninger og tar en uke å fullføre for MNV 4. I tillegg til å være lavere enn en plakett assay er TCID 50 analysen også ikke like følsom (deteksjonsgrense = 200 TCID 50 / ml) på grunn av giftigheten av vevsprøver til RAW 264,7 celler 4. Selv kritiske trinnene i protokollen har blitt beskrevet hele protokollen, gir følgende avsnitt et sammendrag til rette feilsøking. Den mest kritiske trinn i protokollen, er å sikre at RAW 264,7 celler forblir levedyktig hele analysen å støtte virusreplikasjon. Dette kanovervåkes på hvert trinn av analysen via lysmikroskopi. Celleviabilitet sikres på to måter. Først, bør man være forsiktig for ikke å la cellene tørke ut mens håndtering plater. Således beveger platene inokuleres en om gangen, rocked under infeksjonen perioden, og bør forbli lukket når de ikke blir håndtert. Sekund, løsninger lagt inn celler bør være ekvilibrert til ~ 37 ° C. Videre er det viktig for den generelle helsen RAW 264,7 celler for å opprettholde dem i medier som inneholder lav endotoksin serum (&lt;10 EU / ml), som begrenser aktivering av celler. I tillegg har vi observert en høyere feilrate av plakket analysen ved bruk celler fra passasje 30 eller høyere. Selv om dette vil sannsynligvis variere fra laboratorium til laboratorium, er det viktig å ta med en positiv kontroll (for eksempel en prøve med en kjent viral titer) for å sikre reproduserbare titere, spesielt når man bruker høyere passage RAW 264,7 celler. Å begrense bruk av høyere passasje celler, er det tilrådelig å fryse ampuller med tidlig passage celler ved mottak av RAW 264,7-celler og starte en ny kultur fra de frosne ampuller ofte. Starte på nytt med lav passasje cellekulturer vil også være nyttig når cellene viser endrede egenskaper, for eksempel unnlatelse av å følge, endringer i celle morfologi (f.eks fra runde til spinkel og spredt), eller når mycoplasma forurensning er oppdaget. Et annet viktig poeng å ta hensyn til, er å sikre at pipettespissene endres mellom prøvene og under fortynninger. Dette vil sikre nøyaktige seriefortynninger og hindre krysskontaminering mellom prøvene. Den ett trinn i protokoll der samme pipettespissen kan brukes igjen er når serielle fortynninger av den samme prøven tilsettes til brønnene. I så fall bør man starte fra mest fortynnede inokulatet til det minste, og kraftig pipetteres opp og ned når du tegner opp en ny fortynning. Plakett analyseprotokollen er amendable til flere endringer. Én modifikasjon som kan bli gjort når ther er ikke nok celler for inokulere brønner i duplikat er å inokulere bare en enkelt brønn for hver fortynning. Men siden inokulatet volumet er 0,5 ml, må antallet plaques deretter å bli multiplisert med en faktor på 2 for å normalisere til pfu / ml. Plakett Målingen kan også tilpasses for bruk med hvilken som helst annen vedheftende cellelinje som er i stand til å støtte replikering av MNV, og dette har blitt beskrevet for den murine microglial BV-2 cellelinje 8. Andre endringer som kan gjennomføres er tilpasninger som er beskrevet for plakk analysen protokoller utviklet for andre virus. Ved MNV, har følgende modifikasjoner allerede gjennomført vellykket, bruk av metyl cellulose istedenfor Hav Plaque agarose 9, og farging av celler med krystallfiolett eller metylenblått istedenfor nøytral 10 rød, 11. Samlet kan denne protokollen lett tilpasses etter behov for å kvantifisere andre plakk-forming virus eller brukes til OTHeh virus som forårsaker lytiske infeksjoner i RAW 264,7-celler, noe som gjør den til et nyttig verktøy for å kvantifisere infeksiøse viruspartikler generelt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM / Høy glukose </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x Penicillin og streptomycin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM ikke-essensielle aminosyrer </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mm (100x) L-glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Nøytral Red 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirconia / Silica perler </td><td> BioSpec Produkter </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Model 35 Speed ​​Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna elektrolysør Instrument </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Raw 264,7 cellelinje </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Tissue kulturinkubatoren </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Murine norovirus (MNV) er det eneste medlemmet av Norovirus slekten som effektivt vokser i vev kultur 1, 2. Cellelyse og cytopatisk effekt (CPE) observeres under MNV-1-infeksjon av murine dendrittiske celler eller makrofager en. Denne egenskapen av MNV-1 kan brukes til å kvantifisere antallet av infeksiøse partikler i en gitt prøve ved å utføre en plakett assay 1. Plakett analysen er avhengig av evnen av MNV-1 til å lysere cellene og til å danne hull i en konfluent celle monolag, som kalles plakk 3. Flere teknikker kan brukes til å detektere virusinfeksjoner i vevskultur, høstes vev, klinisk og miljøprøver, men ikke alle måle antall infeksiøse partikler (f.eks QRT-PCR). En måte å kvantifisere infeksiøse viruspartikler er å utføre en plakett assay 3, som vil bli beskrevet i detalj nedenfor. En variant på MNV plakk analysen er fluorescent fokus analysen, hvor MNV antigen immunostained i celle monolayers 4. Denne analysen kan være raskere, siden virusantigen uttrykk forut plakkdannelse. Det er også nyttig for titrering virus ikke kan danne plakk. Imidlertid krever fluorescerende fokus analysen ytterligere ressurser utover de av plakk analysen, for eksempel antistoffer og et mikroskop for å telle fokus-dannende enheter. Infeksiøs MNV kan også kvantifiseres ved å bestemme 50% Tissue Culture infeksiøs dose (TCID 50) 3. Denne analysen måler mengden av virus nødvendig for å produsere CPE i 50% av inokulerte vevskultur cellene ved endepunkt titrering 5. Imidlertid er dens deteksjonsgrensen høyere sammenlignet med en plakett assay 4. I denne artikkelen beskriver vi en plakett analyseprotokollen som kan brukes for effektivt å bestemme antall infeksiøse MNV partikler tilstede i biologiske eller miljøprøver 1, 4, 6. Denne metoden er based på fremstillingen av 10-fold serielle fortynninger av MNV-holdige prøver, som brukes for å inokulere et monosjikt av ettergivende celler (RAW 264.7 murine macrophage celler). Virus er tillatt å feste til cellen monolaget for en gitt tidsperiode, og deretter suget før dekker celler med en blanding av agarose og cellekulturmedier. Agar muliggjør spredning av viral avkom til nabocellene samtidig begrense spredning til fjernt beliggende celler. Følgelig er infiserte celler lysert og danner hull i monolaget kjent som plakk. Ved tilstrekkelig spredning av virus, plaques blir synlige etter farging av cellene med fargestoffer, som nøytral rød, metylen blått, eller krystallfiolett. Ved lave fortynninger, stammer hver plakk fra en smittende viral partikkel og dens avkom, som spredte seg til nabocellene. Således, telle antall plakk tillater en å beregne plakk-dannende enheter (PFU) tilstede i den ufortynnede prøven 3.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å kvantifisere infeksiøse partikler av murin norovirus (MNV), som er den eneste norovirus som effektivt replikerer i cellekultur. Plakett analysen utnytter MNV største tropisme for murine makrofager, og kan tilpasses for bruk med biologiske eller miljøprøver inneholdende MNV.

Plakk analysen for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Reverse genetikk Mediated Gjenvinning av Infeksiøs murin Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Konsentrasjon Bestemmelse Gjennom platebedømmelser: Ved hjelp av tradisjonelle og Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En Murine modell av gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinne Prøvetaking metode for påvisning av humant Norovirus på overflater

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage av Murine Lunger å analysere inflammatorisk celleinfiltrasjon

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...