Name: plaque assay for murine norovirus
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Мы благодарим членов Wobus лаборатории для критических замечаний и предложений. Работа в лаборатории CEW было профинансировано запуска средства из Мичиганского университета, гранты развитие карьеры от NIH / NIAID регионального центра передового опыта в области био-защиты и новым инфекционным болезням исследований (RCE) Программа, Область V «Великий Озера &quot;RCE (NIH награду 1-U54-AI-057153) и NIH R01 AI080611. MBG-H. было профинансировано экспериментальной иммунологии (NIH T32 A1007413-16) и молекулярных механизмов в патогенезе микробной (NIH T32 A1007528) обучение грантов в Университете штата Мичиган. JBC была профинансирована Coordenação де Aperfeiçoamento-де-де Pessoal Nivel Superior (CAPES), Бразилиа, Бразилия.

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Метод бляшек для МНВ-1, представленная здесь, способ количественной инфекционных частиц МНВ. Следуя анализ шаги показано на рисунке 3, можно получить воспроизводимые вирусные титры. Предел обнаружения анализа зависит от исходного разведения используются. Когда, начиная с 1:10 разведение образца, как описано выше, предел обнаружения бляшек составляет 10 БОЕ (например, 1 налет виден в разведении 10 -1). Так как каждая доска представляет собой один вирус, бляшек также может быть использован для очистки клональной популяции МНВ, выбирая изолированные бляшки и распространения их, как описано ранее 1. Кроме того, налет очищений также может быть использован для разделения отдельных популяции вируса от смешанных популяций вируса. Ограничение использования доски тест для обнаружения инфекции МНВ, что не все МНВ штаммы образуют бляшки 4. Тем не менее, это может быть возможным, чтобы преодолеть inabiliти некоторых штаммов МНВ, выделенных из животных, с образованием бляшек на серийно пассажи этих вирусов в культуре ткани 7. Альтернативой бляшек является измерение инфекционных частиц через TCID 50 Техника 3, 4. Этот анализ количественно количество вируса, необходимых для производства CPE у 50% привитых культуре ткани клеток после конечной точки разведения и занимает 1 неделю, чтобы закончить на Многовершинном 4. В дополнение к тому медленнее, чем бляшек, TCID 50 Анализ также не столь чувствительны (предел обнаружения = 200 TCID 50 / мл) в связи с токсичностью образцы тканей для RAW 264.7 клетках 4. Несмотря на критические шаги в протоколе были описаны всей протокол, в следующем разделе приводится краткая информация для облегчения поиска и устранения неисправностей. Наиболее важным шагом в протокол, чтобы RAW 264.7 клетки остаются жизнеспособными во всем анализе поддерживать репликацию вируса. Это можетконтролировать на каждом этапе анализа с помощью световой микроскопии. Жизнеспособность клеток обеспечивается двумя способами. Прежде всего, следует позаботиться, чтобы не позволить клетки высыхают при работе с плитами. Таким образом, плиты засевают по одной за раз, качали при заражении период, и должны оставаться закрытыми, когда они не решаются. Во-вторых, решение добавить на клетки должны быть доведены до ~ 37 ° C. Кроме того, это жизненно важно для общего состояния здоровья RAW 264.7 клетками для поддержания их в средах, содержащих низкое эндотоксина сыворотки (&lt;10 КОЕ / мл), что ограничивает активацию клеток. Кроме того, мы наблюдали более высокий процент неудач бляшек при использовании клеток от прохождения 30 или выше. Хотя это, скорее всего, зависят от лаборатории до лаборатории, важно, чтобы включить положительный контроль (например, образца с известным титр вируса) для обеспечения воспроизводимых титры, особенно при использовании выше отрывок RAW 264.7 клетках. Чтобы ограничить использование клетках высших проход, желательно, чтобы заморозить флаконов рано пассаGE клеток после получения RAW 264.7 клетках и создать новую культуру из замороженных флаконов часто. Начиная с более низкими культурами клеток прохождение также будет полезным, когда клетки обладают изменены характеристики, такие как несоблюдение, изменения в морфологии клеток (например, от круглой до тонких и выкладывается), или когда микоплазмы загрязнения не обнаружено. Еще один важный момент обратить внимание на это, чтобы наконечники меняются между образцами и во время разведения. Это позволит обеспечить точное серийные разведения и предотвращения перекрестного загрязнения между образцами. Один шаг в протоколе, где же кончика пипетки можно использовать снова, когда серийных разведений того же образца добавляют в лунки. В этом случае следует исходить из самых разбавленных посевной к мере, и энергично пипетки вверх и вниз при составлении нового разведения. Протокол бляшек является исправимый в нескольких модификациях. Одна из модификаций, которые могут быть сделаны, когда тЗдесь не хватает клеток для посева скважин в двух экземплярах, чтобы привить только одной скважины для каждого разведения. Однако, начиная с посевной объем 0,5 мл, количество бляшек, то должно быть умножено на коэффициент от 2 до нормализовать БОЕ / мл. Бляшек также может быть адаптирована для использования с любым другим сторонником клеточной линии, которая может поддерживать репликацию МНВ, и это было описано для мышиных микроглии BV-2 клеточной линии 8. Другие изменения, которые могут быть реализованы являются адаптациями, которые были описаны для бляшек протоколы, разработанные для других вирусов. В случае МНВ, следующие изменения уже были успешно реализованы, использования метилцеллюлозы вместо моря налет агарозном 9 и окрашивания клеток с кристаллом фиолетового или метиленового синего, а не нейтральный красный 10, 11. В целом, этот протокол может быть легко адаптирована как необходимая для определения других бляшкообразующих вирусы или используются для др.э вирусов, которые вызывают литические инфекции в RAW 264.7 клетках, что делает его полезным инструментом для количественного инфекционных вирусных частиц в целом.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td></tr><tr><td> DMEM / High глюкозы </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x пенициллина и стрептомицина </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 мМ Номера для незаменимых аминокислот </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 мм (100x) L-глютамин </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Плод бычьего сывороточного </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Море налет Агароза </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Нейтральный красный 0,33% </td><td> Сигма </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 мм циркония / Silica бисера </td><td> BioSpec продукты </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Модель 35 Скорость Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna инструмента Lyser </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Сырье 264,7 клеточной линии </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Культура ткани инкубатора </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

Здесь мы опишем метод количественной инфекционных частиц мышиных норовируса (МНВ), которое является единственным норовируса, который эффективно размножается в культуре клеток. Бляшек использует тропизм Многовершинное для мышиных макрофагов и может быть адаптирован для использования с биологической или экологической образцов, содержащих МНВ.

Бляшек на мышиной норовирус

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Обратной генетики опосредованного восстановления инфекционных мышей норовирус

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Экс Vivo Заражение мышиных эпидермиса с вирусом простого герпеса типа 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Мышиной модели группы B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Вагинальный Колонизация

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Бронхоальвеолярное спазмы легких у мышей для анализа воспалительной клеточной инфильтрации

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Анализ фагоцитоза для апоптозных клеток в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...