Name: plaque assay for murine norovirus
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Vi tackar medlemmar i Wobus laboratorium för kritiska kommentarer och förslag. Arbetet i laboratorium CEW har finansierats av nystartade fonder från University of Michigan, en karriärutveckling bidrag från NIH / NIAID Regional Center of Excellence för Bio-försvar och Emerging Infectious Diseases Research (RKS) Program, Region V stora Sjöar &#39;RCE (NIH utmärkelsen 1-U54-AI-057.153) och NIH R01 AI080611. MBG-H. har finansierats av Experimental Immunology (NIH T32 A1007413-16) och de molekylära mekanismer vid Microbial Pathogenesis (NIH T32 A1007528) utbildningsbidrag för University of Michigan. JBC har finansierats av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (slängkappor), Brasilia, Brasilien.

1. Odling av makrofagcellinje RAW 264,7 <ol><li> Bibehåll RAW 264,7-celler (ATCC, katalog # TIB-71) i DMEM-10 medium, som består av hög glukos DMEM med 10% (volym / volym) med låg endotoxin fetalt bovinserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 1 mM icke-essentiella aminosyror, 2 mM L-glutamin. Celler är typiskt hålles i 175 cm 2 vävnadsodlingskolvar innehållande 35 ml medium per kolv och inkuberades vid 37 ° C och 5% CO 2 i en vävnadsodlingsinkubator. Emellertid kan vilken som helst storlek kolv användas med en volym av material som är lämpliga för storleken av kolven. </li><li> Så här delar du celler: aspirera bort de gamla medierna, tillsätt 10 ml av färska DMEM-10 medium till cellerna, och sedan skrapa cellerna från botten av kolven med hjälp av en cell skrapa. Nästa, resuspendera cellerna i en homogen lösning genom att utarbeta celler i en 10 ml pipett och kraftfullt pressa cellerna genom pipettspetsen prEssed mot botten av kolven. Upprepa denna åtgärd minst 3 gånger så cellerna inte längre klumpar ihop. Verifiera genom Ijusmikroskopi att en enkelcellsuspension genererades. Sedan överföra 1 ml (1:10 spädning eller ~ 1x10 7 celler) - 2 ml (1:5 utspädning eller ~ 2x10 7 celler) av cellsuspensionen till en ny 175 cm 2 kolv och bringa den slutliga volymen av media upp till 35 ml. </li><li> Dela upp celler när de är nästan sammanflytande (~ 1x10 8 celler total/175 cm 2 flaskor): var tredje dag om börjar med en 1:10 spädning eller varannan dag om börjar med en 1:5 utspädning. Använd Ijusmikroskopi för att kontrollera cellmorfologi före delning celler. De flesta av cellerna ska se runt och inte aktiverad. Aktiverade celler har granulat och / eller utökade, spinkiga morfologi med bihang. Låt inte cellerna växa över eftersom dessa celler inte normalt bildar plack. Håll koll på passagen nummer och ofta börja om genom att tina en lägre passage alikvot av celler. (Vi använder kanalen 30 som en cut-off). </li></ol> 2. Infektera RAW 264,7 Celler med MNV ymp <ol><li> Seed RAW 264,7 celler i 6-brunnsplattor (3,5 cm i diameter) vid en densitet av 1x10 6 viabla celler / ml i DMEM-10 medium, och tillsätt 2 ml av denna suspension till varje brunn. Det är viktigt att fördela celler jämnt i brunnarna antingen genom gungande plattor hand minst 10 gånger eller genom att använda en gungande apparat för ~ 10 minuter. Inte snurra plattorna eftersom detta kommer att orsaka att cellerna kluster i mitten av brunnen. Placera plattorna i en vävnadsodlingsinkubator (vid 37 ° C och 5% CO 2). Tillåt celler fästa över natten eller i minst 4 h vid 37 ° C. Celler bör vara 60 - 80% sammanflytande för plackanalys och fördelas jämnt över hela brunnen. </li><li> Nästa dag, förbereda viruset inokulum, som kan vara från MNV-infekterade celler i vävnadsodling eller homogeniserade vävnader eller avföringsprover för MNV-infekterade möss. När du använder vävnadsprover, ärtstora piECES av vävnad homogeniseras i 2 ml med skruvkork rör innehållande sterila kiseldioxidpärlor i 1 ml DMEM-10 med användning av en vävnadshomogenisator (t.ex. MagnaLyser, Roche). För avföringsprover bör inte mer än 3 fekal pellets homogeniseras i 1 ml medium. Alla prover fryses sedan (vid -80 ° C) och tinades en gång innan utför plackanalys. </li><li> Bered 10-faldiga utspädningar av viruset inokulum i komplett DMEM-5-medium, som består av DMEM / hög glukos, 5% (volym / volym) med låg endotoxin fetalt bovint serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 1 mM icke-essentiella aminosyror, 2 mM L-glutamin. </li><li> Tio-faldiga seriespädningar bereds i 24-brunnars plattor: en repeater pipett används för att fördela 1,35 ml medium i flera brunnar är 10 -1 utspädning genom blandning 1,35 ml medium och 0,15 ml virusinnehållande prov, och därefter 0,15 ml av 10 -1 utspädningen sätts till 1,35 ml medium för att göra 10 -2 dilution och så vidare. Det är viktigt att byta tips varje gång du gör en ny spädning. En multikanalpipett kan användas för att göra spädningar av flera prov samtidigt med två spetsar passar i en brunn av en 24-brunnsplatta överför en total volym av 0,15 ml per brunn (se figur 3A). </li><li> Ett typiskt utspädningsområde för vävnadshomogenat och fekala innehållet är 10 -1 till 10 -3. Emellertid plack från dessa prover tenderar att vara mindre jämfört med de från prov vävnadsodling. Vidare, i vissa fall en 1:100 spädning av fekala prover behövs för att tillräckligt späda ut några toxiska komponenter av avföring som kan störa cellmonoskiktet, och hindrar därmed förmågan att räkna plack. Utspädningen utbud av lysat vävnadsodling beror på tidpunkten för intresse under virusets livscykel. Utspädningar som går upp till 10 -9 kan behövas på toppen av infektion. </li><li> Efter de seriella utspädningar framställes, märka 6-brunnars plattas som innehåller råa 264,7 monolager (från avsnitt 2.1) med provet namn och spädningar är pläterad. En platta i taget, ta bort alla medier genom att slå ut eller aspirera det. Omedelbart efteråt lägga 0,5 ml utspätt prov till en brunn, upprepa med en dubblett väl, innan du fortsätter till nästa utspädning. När alla 3 spädningar läggs till en platta, lutning tallrik och tillbaka för hand för att säkerställa att alla celler har täckt. Handtag en platta vid en tidpunkt för att säkerställa att cellerna inte kommer att torka ut. </li><li> Efter tillsats av 0,5 ml av utspädningarna till varje brunn, stapla plattorna upprätt och inkubera dem under 1 timme vid rumstemperatur. Eftersom volymen till varje brunn är inte tillräcklig för att täcka monolagret helt plattorna måste försiktigt lutas fram och tillbaka för hand var 10-15 min eller placeras på en gungande apparat (~ 18 svängningar per minut). Detta förhindrar att celler från att torka ut. </li></ol> 3. Agaros med låg smältpunkt (SeaPlaque) Överlägg Framställning <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Observera: det är tillrådligt att ha flera flaskor med autoklaverat SeaPlaque agaros förberedas i god tid. Agaros kan åter smältas i en mikrovågsugn före användning. <ol><li> Beräkna mängden överlägg som erfordras för den totala volymen av plattor innan 1 h inkubation är klar. Den volym som behövs är 2 ml / brunn eller 12 ml/6-well platta. Förbered agaros (se avsnitt 3,2) och media (se avsnitt 3.3) separat. </li><li> För att framställa agaros, suspendera 3 g SeaPlaque agaros i en total volym av 100 ml destillerat vatten (3% vikt / volym) i en glasflaska. Autoklav under 20-30 min. (Om agaros redan utarbetades innan hand, åter smälta agaros i mikrovågsugn.) Det är viktigt att jämvikt SeaPlaque agaros till 42 ° C i ett vattenbad innan användning för om agarosen är för varmt, kommer det att döda cellerna. Att vatten är lika med eller över nivån för agarosen att undvika oönskad stelning. </li><li> För att framställa mediet: göra 100 ml 2x MEM-medium, som består av2x MEM, 10% (volym / volym) med låg endotoxin fetalt bovinserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 4 mM L-glutamin. Ekvilibrera media till 37 ° C i ett vattenbad. </li><li> Blanda både SeaPlaque agaros och 2x medier MEM tillsammans i en steril flaska i ett 1:1-förhållande omedelbart innan överlagra de infekterade cellmonoskikt. Om mer än 200 ml overlay behövs, delad volym i flera flaskor och hålla i 37 ° C vattenbad tills det ska användas. </li><li> Vid slutet av 1 h inkubation (se avsnitt 2,7), aspirera inokulatet bort av varje brunn. Tillsätt långsamt 2 ml överlägg till kanten av varje brunn genom att placera pipettspetsen mot väggen i varje brunn. Upp till 5 plattor kan hanteras samtidigt utan celler uttorkning. </li><li> Låt överlägget stelna under cirka 10 minuter i rumstemperatur innan du placerar plattor upprätt i vävnadsodling inkubator. Inkubera plattorna under 48 timmar vid 37 ° C i 5% CO 2. </li><li> Efterinkubationstiden, plack är svagt synliga för blotta ögat, så kontrollera ofärgade plattor för närvaro av plack. Om inga plack är synliga, inkubera under ytterligare 4 timmar och kontrollera igen. Dock bör den maximala inkubationstiden inte överstiga 72 timmar. </li></ol> 4. Visualisering av plack genom neutral röd färgning <ol><li> För att visualisera plack, är den neutrala röda färgningen lösning framställd genom tillsats av 3 ml neutralt rött (0,33% vikt / volym i DPBS, Sigma, katalog # N2889) till varje 97 ml 1 x PBS (vävnadsodling grad, Mg 2 + -, Ca 2 + - gratis, Gibco, katalog # 10010). Beräkna volymen av neutral röd färglösning behövs för experimentet: 12 ml neutralrött färglösning krävs för varje 6-brunnsplatta. Tillsätt 2 ml till varje brunn. Även om vissa plackanalys protokoll kräver agarosplugg att avlägsnas från brunnarna, i detta protokoll den neutrala röda färglösning tillsättes direkt på överlägget. </li><li> Efter en timme icubation vid 37 ° C, kontrollera om plack syns med neutral röd färgningslösning fortfarande i brunnar. Om plack inte uppenbart, att färgningen fortsätter för en annan timme. Fortsätt inkubering tills plack är synliga. (Notera:. Färgning för mer än 3 timmar är inte optimal och om inga plack är synliga i det positiva kontrollprovet efter 3 h av färgning, gjorde plackanalys inte fungerar korrekt) Efter färgningen är klar, aspirera neutral röd färglösning , se till att agarosplugg störs inte och sedan vidare till att räkna plack. </li><li> Räkna plack genom att placera plattan upp och ner på en ljuslåda och markera en punkt på räknade plack för att undvika dubbla räknas. Välj utspädning att räkna plack i brunnar där plack är tydligt separerade (dvs ingen visuell bevis på plack sammansmältning). Om möjligt, räkna plack vid två spädningar. Det är viktigt att notera att plackstorlek kan variera mellan MNV stammar, virus inokulum, och beror påtillståndet hos RAW 264,7 celler under plackanalysen. </li><li> Om inga plack är synliga i en brunn, antingen det var något virus närvarande i provet eller mängden virus var under gränsen för detektering av plackanalys. I detta fall, brunnarna fläcken röda med en liknande färg som andra plack-innehållande brunnar. Alternativt, är frånvaron av plack observeras även när det finns alltför många virala partiklar närvarande i en given utspädning. Detta leder till lys av hela monoskiktet och brunnarna verkar orange / gul färg. </li><li> Beräkna virustitrar. Lägg det antal plack i både brunnar i en enkel spädning och multiplicera med utspädningsfaktorn (dvs. 1 ml om 2 brunnar är infekterade med 0,5 ml). Detta kommer att ge mängden av plackbildande enheter (PFU) i inokulat volym av 1 ml. Till exempel i figur 4 vid 10 -2 utspädning har en väl (märkt &quot;II&quot;) 14 plack och den andra brunnen (märkt &quot;V&quot;) har 17 plack. Sålunda kommer den virala titern vara 14x10 2 + 17x10 2 = 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Representativa resultat Infektiösa MNV-1 partiklar kan kvantifieras med användning av en plackanalys som beskrivs schematiskt i figur 1. Figur 2A visar en brunn med ett monoskikt av RAW 264,7 celler strax före infektion, medan figur 2B visar tre synliga plack indikeras med romerska siffror I, II och III i en brunn. Enskilda steg i analysen visas i figurerna 3A till F. Figur 3A visar framställningen av 10-faldig spädningsserie av ett virus-innehållande prov. Figur 3B visar överföringen av spädningar till dubbla brunnar i en 6-brunnsplatta. Figur 3C visar den vaggande apparat som används för att inkubera RAW 264,7 celler med inokulatet vid rumstemperatur under 1 timme Figur 3D visar celler som överlagras med SeaPlaque:. MEMblandning. Figur 3E visar en platta vid rumstemperatur för att tillåta överlagring stelna, medan figur 3F visar celler som färgades med en 0,01% neutral röd lösning 48 timmar senare. Efter färgning celler för 1-3 timmar och aspirera neutralt rött färgningslösningen, plack är synliga och kan räknas (figur 4). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figur 1. Skiss över MNV plackanalys protokollet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figur 2. Representativa bilder av en brunn i en monoskikt före infektion och efter bildningen av plack. A) RAW 264,7 celler odlades över natten och avbildas under ett ljusmikroskop vid 20x förstoring. B) Celler färgades med en 0,01% neutral röd lösning efter 48 timmarr av infektion och visualiserades under ett ljusmikroskop vid 4x förstoring. Romerska siffror I, II, och III indikerar tre synliga plack. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figur 3. Representativa bilder av de olika stegen plackanalys. A) MNV-1 inokulat bereds i 10-faldiga utspädningar. B) Inokulum sättes till cellmonoskikten i dubbla brunnar. C) Celler och ymp inkuberas genom gunga under 1 timme vid rumstemperatur. D) cellerna med en 1:1 blandning av agaros SeaPlaque och 2x MEM-medium. E) Plattorna inkuberas under 10 min vid rumstemperatur för att tillåta överlagring stelna. F) Färgning av celler med neutralt rött färgningslösningen 48 timmar efter infektion. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figur 4. MNV-1 bildar plack i cell monolenAyers. Visas här är en representativ plackanalys plattan 48 timmar efter infektion, visar plack färgade med neutral röd färgning lösning efter 1 h inkubation. Plattan visar duplikatbrunnar av tre 10-faldiga utspädningar. Brunnar märkta med romerska siffror I och IV motsvarar 10-1 utspädning, II och V motsvarar 10-2 utspädning, III och VI motsvarar 10-3 utspädning. Den virustiter av provet visas nedan (se avsnitt 4.5 för information om beräkning).

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Den plackanalys metoden för MNV-1 presenteras här är ett sätt att kvantifiera infektiösa MNV partiklar. Genom att följa de analyssteg som illustreras i figur 3, kan man erhålla reproducerbara virala titrar. Detektionsgränsen för analysen beror på den använda start utspädning. Vid start med en 1:10 spädning av prov som beskrivits ovan, är gränsen för detektion av plackanalys 10 pfu (dvs 1 plack syns på 10 -1 utspädning). Eftersom varje plack representerar en enda virus kan plackanalys också användas för att rena klonala populationer av MNV genom att plocka isolerade plack och föröknings dem som beskrivits tidigare 1. Dessutom, kan plackreningar också användas för att separera en enskild viruspopulationen från blandade populationer virus. En begränsning att använda en plackanalys för detektion av MNV infektion är att inte alla MNV stammar bildar plack 4. Emellertid kan det vara möjligt att övervinna inability av vissa MNV stammar, isolerade ur djur, för att bilda plack genom seriellt passage dessa virus i vävnadskultur 7. Ett alternativ till plackanalys är att mäta infektiösa partiklar via TCID 50 tekniken 3, 4. Denna analys kvantifierar den mängd virus som krävs för att producera CPE i 50% av ympade vävnadskulturceller efter endpoint utspädningar och tar 1 vecka att slutföra för MNV 4. Förutom att vara långsammare än en plackanalys är TCID 50 analysen inte heller så känsligt (detektionsgräns = 200 TCID 50 / ml) på grund av toxiciteten av vävnadsprov för RAW 264,7 celler 4. Även kritiska steg i protokollet har beskrivits hela protokollet ger följande avsnitt en sammanställning för att underlätta felsökning. Det mest kritiska steget i protokollet är att säkerställa att RAW 264,7 celler förblir viabla genom hela analysen att stödja virusreplikation. Detta kanövervakas vid varje steg av analysen genom Ijusmikroskopi. Cellviabilitet säkerställs på två sätt. Först bör man inte låta cellerna torka vid hantering plattor. Således är plattorna inokuleras en i taget, gungade under infektionen perioden och bör förbli stängda när de inte hanteras. Andra lösningar läggs på celler bör vara jämvikt till ~ 37 ° C. Dessutom är det viktigt för den allmänna hälsan hos RAW 264,7 celler för att hålla dem i media innehållande låg endotoxin serum (&lt;10 EU / ml), vilket begränsar aktivering av celler. Dessutom har vi observerat en högre felfrekvens i plackanalys vid användning celler från passagen 30 eller högre. Även om detta kommer sannolikt att variera från labb till labb, är det viktigt att inkludera en positiv kontroll (t.ex. ett prov med en känd virustiter) för att säkerställa reproducerbara titrar, speciellt när man använder högre passage RAW 264,7 celler. För att begränsa användningen av högre passage celler, är det lämpligt att frysa flaskor av tidig PassaGE celler vid mottagandet av RAW 264,7 celler och starta en ny kultur från de frysta flaskorna ofta. Börja om med låga kulturer passage celler kommer också att vara till hjälp när celler uppvisar förändrade egenskaper, såsom underlåtenhet att följa förändringar i cellmorfologin (t.ex. från runda till spinkiga och sprida ut), eller när mykoplasmkontaminering har upptäckts. En annan viktig punkt att uppmärksamma är att pipettspetsar ändras mellan prover och under spädningar. Detta kommer att säkerställa korrekta seriespädningar och förhindra korskontaminering mellan prover. Det ett steg i protokollet där samma pipettspetsen kan användas igen är när serieutspädningar av samma prov sättes till brunnarna. I så fall bör man börja från den mest utspädda inokulatet till minst och kraftfullt pipettera upp och ner vid upprättandet av ett nytt utspädning. Den plackanalys protokollet är kan ändras på flera ändringar. En modifiering som kan göras när thär är inte tillräckligt celler för ympning brunnar i duplikat är att ympa en enda källa för respektive spädning. Eftersom inokulatet volymen är 0,5 ml, måste antalet plack sedan multipliceras med en faktor av 2 att normalisera till pfu / ml. Den plackanalys kan också anpassas för användning med någon annan vidhäftande cellinje som har förmåga att stödja replikation av MNV, och detta har beskrivits för den murina microglial BV-2-cellinjen 8. Andra modifieringar som kan genomföras är anpassningar som har beskrivits för protokoll plackanalys utvecklats för andra virus. Vid MNV har följande ändringar redan genomförts med framgång, användning av metylcellulosa istället för Sea Plaque agaros 9, och färgning av celler med kristallviolett eller metylenblått i stället för neutralrött 10, 11. Sammantaget kan detta protokoll enkelt anpassas efter behov för att kvantifiera andra plackbildande virus eller användas för OTHER virus som orsakar lytiska infektioner i RAW 264,7 celler, vilket gör det ett användbart verktyg för att kvantifiera infektiösa viruspartiklar i allmänhet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM / hög glukos </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11.935 </td></tr><tr><td> 100x Penicillin och streptomycin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM icke-essentiella aminosyror </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea Plaque agaros </td><td> Lonza </td><td> 50.100 </td></tr><tr><td> Neutral Röd 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10.010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirconia / Silica pärlor </td><td> Biospec Products </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modell 35 Hastighet Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lysér Instrument </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Rå 264,7 cellinjen </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Vävnadsodlingsinkubator </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Murin Norovirus (MNV) är den enda medlemmen i Norovirus släktet som effektivt växer i vävnadskultur 1, 2. Cellys och cytopatisk effekt (CPE) observeras under MNV-1-infektion av murina dendritiska celler eller makrofager 1. Denna egenskap av MNV-1 kan användas för att kvantifiera antalet infektiösa partiklar i ett givet prov genom att utföra en plackanalys 1. Plack-analysen bygger på förmågan hos MNV-1 att lysera celler och bilda hål i en sammanflytande cellmonoskikt, som kallas plack 3. Flera tekniker kan användas för att detektera virala infektioner i vävnadskultur, skördades vävnad, kliniska och miljöprover, men inte alla mått antalet infektiösa partiklar (t.ex. QRT-PCR). Ett sätt att kvantifiera infektiösa virala partiklar är att utföra en plackanalys 3, som kommer att beskrivas i detalj nedan. En variation på MNV plackanalysen är fluorescensföreningenescent fokus-analys, där MNV antigen immunofärgades i cellmonoskikten 4. Denna analys kan vara snabbare, eftersom virusantigen uttryck föregår plackbildning. Det är också användbart för att titrera virus inte kan bilda plack. Emellertid kräver fluorescerande fokus-analysen ytterligare resurser utöver dem av plackanalys, såsom antikroppar och ett mikroskop för att räkna fokus-bildande enheter. Infektiös MNV kan också kvantifieras genom bestämning av den 50% Tissue Culture Dos Infektiös (TCID 50) 3. Denna analys mäter mängden virus som krävs för att producera CPE i 50% av ympade vävnadskulturceller genom slutpunkt titrering 5. Emellertid är dess detektionsgräns högre jämfört med en plackanalys 4. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll plackanalys som kan användas för att effektivt bestämma antalet infektiösa MNV partiklar som finns i biologiska eller miljömässiga prover 1, 4, 6. Denna metod är based om förberedelserna inför 10-faldiga seriespädningar av MNV innehållande prover, som används för att ympa ett monoskikt av tillåtande celler (RAW 264,7 murina makrofagceller). Virus tillåtelse att ansluta till cellmonoskiktet under en given tidsperiod och därefter aspireras innan täcker celler med en blandning av agaros och cellodlingsmedia. Agar möjliggör spridning av viral avkomma till angränsande celler och samtidigt begränsa spridning till avlägset belägna celler. Följaktligen är infekterade celler lyseras och bildar hål i monoskiktet kallas plack. Vid tillräcklig spridning av viruset, plack blir synliga efter färgning av celler med färgämnen, såsom neutralt rött, metylenblått, eller kristallviolett. Vid låga spädningar, kommer varje plack från en infektiös viruspartikel och dess avkomma, som spred sig till angränsande celler. Sålunda räknar antalet plack gör att man kan beräkna plackbildande enheter (PFU) närvarande i outspädda provet 3.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

Här beskriver vi en metod för att kvantifiera infektiösa partiklar av murint norovirus (MNV), vilket är den enda norovirus som effektivt replikerar i cellodling. Den plackanalys utnyttjar MNV s tropism för murina makrofager och kan anpassas för användning med biologiska eller miljömässiga prover innehållande MNV.

Plackanalys för murin Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Omvänd genetik Medierad Återvinning av infektiös Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Koncentration Fastställande Genom plackanalyser: med hjälp av traditionella och Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion av Murine Epidermis med herpes simplex virus typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En musmodell av grupp B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lungsköljning av murina lungor Analysera infiltration av inflammatoriska celler

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Fagocytosanalys för apoptotiska celler i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...