Name: monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av bidrag från NIH och ACS, däribland T32CA009135, CA133027, CA070723 och CA022443. Bill Sugden är en American Cancer Society Research Professor.

1. Teknik av celler med synliga plasmider <ol><li> Använd standard restriktionsdigerering eller homologa tekniker rekombination att införa ett DNA-fragment som innehöll cirka 250 kopior av laktos operatorsekvensen (LACO) i plasmiden att vara visualiseras. Vår plasmid var en bacmid av ca 170 kbp och innehöll hela genomet av Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV) och kodade resistens mot hygromycin 12. </li><li> Införa LACO-innehållande plasmid-DNA in i däggdjursceller genom transfektion med Lip...

<ol>
	<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li><li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi's+sarcoma.">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li><li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology 2 volume set. , (2006).</li><li>Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+latent+Epstein-Barr+virus+genomes+in+Raji+cells.">Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells.</a> J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).</li><li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EBV+nuclear+antigen+1+(EBNA1)+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold.">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li><li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner.">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li><li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells.">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li><li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence.">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li><li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV's+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells.">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li><li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+Kaposi's+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals.">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li><li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome:+application+for+genetic+analysis.">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+pixels,+and+gray+levels:+digitizing+image+data.">Points, pixels, and gray levels: digitizing image data.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+enhancement+by+deconvolution.">Image enhancement by deconvolution.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).</li></ol>

Metoden som beskrivs här kan användas för att följa plasmider i levande däggdjursceller över tiden över flera generationer. Genom att begränsa exponeringen för excitationsljus, har vi använt dessa tekniker för att följa celler från nyligen delade par genom kolonier av 16-32 celler, som representerar minst 72 timmar och 3 divisioner cell. Dessa experiment ger information som inte kan erhållas från statiska analyser såsom kvantitativ PCR, Southern blotting och fisk. Det är vik...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11.965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31.985 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomycinsulfat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin </td><td> Calbiochem </td><td> 400.050 </td><td> 400 pg / ml för SLK, 300 pg / ml för HeLa </td></tr><tr><td> Isopropyl-BD-tiogalaktosid (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Slutlig koncentration 200 pg / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15.630 </td><td></td></tr><tr><td> Glas-botten rätter </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-10-C- </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> Neutral vita LED </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Filter Cube 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Plan-Apochromat 63x/1.4 mål </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD kamera </td><td> Ljustekniska </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol mini </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 digitala </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI Controller 3700 digital </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Objektiv värmare </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Steg uppvärmning insats P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Steg-top Inkubator S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Luftfuktare System </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy

Några naturligt förekommande plasmider upprätthålls i däggdjursceller. Bland dessa är genomen hos gamma-herpesvirus, inklusive Epstein-Barr-virus (EBV) och Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV), som orsakar multipla humana maligniteter 1-3. Dessa två genomen replikeras på en licensierad sätt, var och en med en enda viralt protein och cellulär replikering maskiner och skickas till dotterceller under celldelning trots deras saknar traditionella centromerer 4-8. Mycket arbete har gjorts för att karakterisera replikationer av dessa plasmid genomen med metoder som Southern blotting och fluorescens in situ hybridisering (FISH). Dessa metoder är begränsade, dock. Kvantitativ PCR och Southern blöts ger information om det genomsnittliga antalet plasmider per cell i en population av celler. FISH är en enkel-cellanalys som avslöjar både det genomsnittliga antalet och fördelningen av plasmiden<html> s per cell i populationen av celler men är statisk, så ingen information om förälder eller avkomma av den undersökta cellen. Här beskriver vi en metod för att visualisera plasmider i levande celler. Denna metod är baserad på bindningen av en fluorescent märkt laktosrepressorproteinet till flera ställen i plasmiden av intresse 9. DNA: t av intresse är konstruerad för att omfatta cirka 250 tandemupprepningar av laktos operatören (LACO) sekvens. LACO specifikt bunden av laktosrepressorproteinet (LACI), som kan smältas till ett fluorescerande protein. Fusionsproteinet kan antingen uttryckas från den manipulerade plasmiden eller introduceras genom en retroviral vektor. På detta sätt, är DNA-molekyler taggade fluorescent och därmed bli synlig via fluorescensmikroskopi. Fusionsproteinet är blockerad från att binda plasmid-DNA genom odling av celler i närvaro av IPTG tills plasmiderna är redo att ses. ontent &quot;&gt; Detta system tillåter plasmiderna som skall övervakas i levande celler genom flera generationer, avslöjar egenskaper hos deras syntes och uppdelning till dottercellerna. Ideala celler är vidhäftande, lätt transfekterade, och har stora kärnor. Denna teknik har använts för att fastställa att 84% av EBV-härledda plasmider syntetiseras varje generation och 88% av den nysyntetiserade plasmiderna partitionen troget till dotterceller i HeLa-celler. Par av dessa EBV plasmider sågs vara bundna till eller associeras med systerkromatider efter deras syntes i S- fas tills de ansågs att separera som systerkromatider separerade i Anafasa 10. Metoden används för närvarande för att studera replikering av KSHV genomet i HeLa-celler och celler SLK. immortaliseras humana epitelceller, och SLK celler immortaliserade HeLa-celler human endotel celler. Även SLK celler ursprungligen härstammar från en KSHV lesion, varken HeLa eller SLK cellinje Harb naturligtOrs KSHV genomen 11. Förutom att studera virusreplikation, kan denna visualisering teknik användas för att undersöka effekterna av tillägg, borttagning eller mutation av olika element DNA sekvens på syntes, lokalisering och fördelning av andra rekombinanta plasmid-DNA.

<html> Maximal intensitet projektioner av z-stackar som förvärvats i ett representativt experiment visas i figur 3. Typiska plasmid signaler närvarande i 3-8 skivor av z-stacken, beroende på om de representerar en eller kluster av plasmider. I fallet av EBV-och KSHV-härledda plasmider, signalerna rör sig långsamt i cellen tills cellen når mitos. Cellerna själva migrera under loppet av experimentet. De blir också sfärisk och lossa från skålen under mitos. Cellcykeln för friska HeLa och SLK c...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

En metod att observera individuella DNA-molekyler i levande celler beskrivs. Tekniken är baserad på bindningen av en fluorescent märkt lac-repressor-protein till bindningsställen manipulerade i DNA av intresse. Denna metod kan anpassas att följa många rekombinanta DNA i levande celler över tiden.

Övervakning plasmidreplikation i Live däggdjursceller över flera generationer genom fluorescensmikroskopi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detektion av intracellulära genuttryck i levande celler av Murine, Mänsklig och svin användning av fluorescens-märkta Nanopartiklar

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analys: Icke-invasiv Adrenal Övervakning av equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...