Name: use of time lapse microscopy to visualize anoxia-induced suspended animation in c. elegans embryos
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00
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Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento por los aportes y comentarios de los miembros del Laboratorio de Padilla. Cepas de nematodos en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). Reconocemos y agradecemos el Dr. Lon Turnbull de asistencia técnica con microscopía confocal. Este trabajo ha sido financiado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF-IOS, CARRERA) para PAP

1. Preparación de la muestra <ol><li> Producir u obtener apropiado C. transgénico elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas o de Genética Caenorhabditis Stock Center (CGC) o colega. En este caso estamos usando la cepa TH32 (pastel-1 :: TBG-1 :: GFP; pastel-1 :: GFP :: H2B) 5 para visualizar los cromosomas y los centrosomas como marcadores para la división celular. </li><li> Generar una población sincronizado mediante uno de tres métodos: 1) se ...

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	<li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans.">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li><li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation,+diapause+and+quiescence:+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans.">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer.">Dauer.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief,+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest.">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li><li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anoxia. , (2012).</li><li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPP-16/Nup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans.">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li><li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans.">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause.">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li></ol>

La privación de oxígeno y la animación suspendida Aunque la exposición a la privación de oxígeno severa puede ser fatal para algunos organismos, algunos organismos son capaces de sobrevivir a la exposición a la anoxia. En el caso de C. elegans, la supervivencia de la exposición anoxia depende de la etapa de desarrollo y respuesta a la anoxia es la entrada en un estado de animación suspendida reversible en el que se detuvo a varios procesos biológicos observables. Los procesos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivos / Equipo </td><td></td><td></td><td> Composición </td></tr><tr><td> Solución de hipoclorito </td><td></td><td></td><td> 0,7 g de KOH, 12 ml de NaOCl al 5%, llevar a 50 ml con ddH 2 0 </td></tr><tr><td> M9 buffer de </td><td></td><td></td><td> 3 g de KH 2 PO 4, 11 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 por 1 L ddH 2 O </td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;x1&quot; x1.0 mm </td></tr><tr><td> Ronda micro cubreobjetos </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 72223-01 </td><td> Diámetro 25 mm </td></tr><tr><td> Halocarbono 700 </td><td> Sigma </td><td> H8898-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Anestésico </td><td></td><td></td><td> 0,5% tricaine, 0,05% tetramisol </td></tr><tr><td> Leiden Cerrado perfusión Microincubator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> UHP Nitrógeno </td><td> Calgaz (Air Liquide) </td><td></td><td> &gt; 99,9990% N 2 &lt;2 ppm de O 2 </td></tr><tr><td> Los tubos de plástico </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0,062 &quot;ID x 0.125&quot; OD </td></tr><tr><td> Microscopio Confocal Spinning disco </td><td> McBain Sistemas </td><td></td><td> Zeiss invertido microscopio óptico del sistema, iluminación epifluorescente, CSU-10 Yokogawa escáner confocal, Hamamatsu multiplicador de electrones CCD cámara. </td></tr></tbody></table>

use of time lapse microscopy to visualize anoxia-induced suspended animation in c. elegans embryos

Caenorhabdits elegans se ha usado extensivamente en el estudio de la resistencia a la tensión, que se ve facilitado por la transparencia de las fases adultas y el embrión así como por la disponibilidad de mutantes genéticos y cepas transgénicas que expresan una miríada de 1-4 proteínas de fusión. Además, los procesos dinámicos tales como la división celular se puede ver con la etiqueta fluorescente proteínas indicadoras. El estudio de la mitosis se puede facilitar mediante el uso de experimentos con lapso de tiempo en los diferentes sistemas, incluyendo organismos intactos, por lo que la temprana C. embrión elegans es muy adecuado para este estudio. Aquí se presenta una técnica mediante la cual la formación de imágenes in vivo de estructuras subcelulares en respuesta a anóxica (99,999% N 2; &lt;2 ppm O 2) el estrés es posible con un flujo de gas a través de la configuración sencilla en un microscopio de alta potencia. Una cámara de microincubation se utiliza en conjunción con el flujo de gas de nitrógeno a través de un microscopio y disco giratorio confocalpara crear un ambiente controlado en el que los animales pueden obtener imágenes in vivo. Uso de GFP-etiquetados tubulina gamma y la histona, la dinámica y la detención de la división celular puede ser controlada antes, durante y después de la exposición a un ambiente privado de oxígeno. Los resultados de esta técnica son de alta resolución, videos detalladas y las imágenes de las estructuras celulares dentro de blastómeros de embriones expuestos a privación de oxígeno.

C. elegans embriones expuestos a privación de oxígeno grave (anoxia) son capaces de sobrevivir al detener procesos biológicos, incluyendo el desarrollo y la división celular 7. La detención inducida por anoxia de la división celular se puede monitorizar, en un nivel sub-celular, mediante el uso de una cámara de microincubation en conjunción con flujo de nitrógeno y gas a través de un microscopio confocal de disco giratorio para crear un ambiente controlado en el que los animales pueden obte...

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Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Descrito aquí es un<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de imagen sub-estructuras celulares en animales expuestos a la anoxia usando un flujo de gas a través de la cámara de microincubation en conjunción con un microscopio confocal de disco giratorio. Este método es sencillo y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una variedad de parámetros experimentales y los sistemas del modelo.

El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse

Investigación

Biología

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De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

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Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

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La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

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RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

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RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

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Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

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