Name: use of time lapse microscopy to visualize anoxia-induced suspended animation in c. elegans embryos
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos at JoVE.com

Vi vill framföra vår uppskattning för de synpunkter och kommentarer från medlemmar i Padilla Lab. Nematoder stammar i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Vi erkänner och tackar Dr Lon Turnbull för tekniskt bistånd med konfokalmikroskopi. Detta arbete har fått stöd av ett stipendium från National Science Foundation (NSF-IOS, karriär) till PAP

1. Provberedning <ol><li> Producera eller få lämplig transgen C. elegans stam av intresse med transgena metoder eller från Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) eller kollega. I det här fallet använder vi stam TH32 (paj-1 :: TBG-1 :: GFP, paj-1 :: GFP :: H2B) 5 för att visualisera kromosomer och centrosomes som markörer för celldelning. </li><li> Skapa en synkroniserad population genom att använda någon av tre metoder: 1) upplösas gravida vuxna hypokloritlösning o...

<ol>
	<li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans.">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li><li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation,+diapause+and+quiescence:+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans.">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer.">Dauer.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Longevity and stress in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).</li><li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations.">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li><li>Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li><li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief,+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest.">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li><li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anoxia. , (2012).</li><li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPP-16/Nup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans.">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li><li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint.">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li><li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope.">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li><li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans.">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause.">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li></ol>

Syrebrist och skendöd Även exponering för svår syrebrist kan vara dödlig för vissa organismer, vissa organismer kan överleva exponering för anoxi. I fallet av C. elegans, beroende överlevnad anoxi exponering på utvecklingsstadiet och svar på syrebrist är inträde i en reversibel tillstånd av skendöd i vilken ett antal observerbara biologiska processer arresteras. Celldelning, utveckling, rörelse, kost och reproduktiva processer upphöra tills syre återinförs i miljön ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenser / Utrustning </td><td></td><td></td><td> Sammansättning </td></tr><tr><td> Hypokloritlösning </td><td></td><td></td><td> 0,7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, tillföra 50 ml med DDH 2 0 </td></tr><tr><td> M9 buffert </td><td></td><td></td><td> 3 g KH 2 PO 4, 11 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 per 1 L DDH 2 O </td></tr><tr><td> Glas mikroskopobjektglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;x1&quot; X1.0 mm </td></tr><tr><td> Rund mikro täckglas </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72.223-01 </td><td> 25 mm diameter </td></tr><tr><td> Halocarbon Oil 700 </td><td> Sigma </td><td> H8898-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Bedövningsmedel </td><td></td><td></td><td> 0,5% TRICaine, 0,05% tetramisol </td></tr><tr><td> Leiden Stängt Perfusion Microincubator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 650.041 </td><td></td></tr><tr><td> UHP Kväve </td><td> Calgaz (Air Liquide) </td><td></td><td> &gt; 99,9990% N 2 &lt;2 ppm O 2 </td></tr><tr><td> Plastslang </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0,062 &quot;ID x 0,125&quot; OD </td></tr><tr><td> Spinning Disk konfokalmikroskop </td><td> McBain Systems </td><td></td><td> Zeiss inverterade optiskt mikroskop, epifluorescens belysningssystem, CSU-10 Yokogawa konfokala skanner, Hamamatsu elektron multiplikator CCD-kamera. </td></tr></tbody></table>

use of time lapse microscopy to visualize anoxia-induced suspended animation in c. elegans embryos

Caenorhabdits elegans har använts i stor utsträckning i studier av stresstålighet, vilket underlättas av öppenheten i den vuxna och embryo stadier samt av tillgången av genetiska mutanter och transgena stammar som uttrycker en myriad av fusionsproteiner 1-4. Dessutom kan dynamiska processer såsom celldelning visas med fluorescensmärkta reporter proteiner. Studien av mitos kan underlättas genom användning av time-lapse experiment i olika system inklusive intakta organismer, alltså den tidiga C. elegans embryo väl lämpad för denna studie. Presenteras här är en teknik med vilken in vivo avbildning av sub-cellulära strukturer som svar på anoxiska (99,999% N 2, &lt;2 ppm O 2) stress är möjligt med en enkel gasflöde genom installationen på en kraftfull mikroskop. En microincubation kammare används i kombination med kvävgas flöde genom och en roterande skiva konfokalmikroskopatt skapa en kontrollerad miljö där djur kan avbildas in vivo. Använda GFP-märkta gamma tubulin och histon, kan den dynamik och gripandet av celldelning övervakas före, under och efter exponering för en syre-berövade miljö. Resultaten av denna teknik är högupplösta, detaljerade videor och bilder av cellulära strukturer inom blastomerer av embryon utsätts för syrebrist.

C. elegans embryon utsätts för svår syrebrist (anoxi) kan överleva genom att arrestera biologiska processer, inklusive utveckling och celldelning 7. Den syrebrist-inducerad gripandet av celldelning kan övervakas på en sub-cellulär nivå, med hjälp av en microincubation kammare i samband med kvävgas strömma igenom och en snurrande skiva konfokalmikroskop för att skapa en kontrollerad miljö där djur kan avbildas in vivo (Figur 1). Cellulära strukturer av intresse...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos at JoVE.com

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Beskrivs här är ett<em&gt; In vivo</em&gt; Teknik att avbilda subcellulära strukturer i djur som exponerats för anoxi användning ett gasflöde genom microincubation kammare i samband med en roterande skiva konfokalmikroskop. Denna metod är enkel och tillräckligt flexibel för att passa en mängd olika experimentella parametrar och modellsystem.

Användning av Time Lapse mikroskopi för att visualisera Anoxia-inducerad skendöd i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryon

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Övervakning Actin demontering med Time-lapse Mikroskopi

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryon med en Epifluorescent Mikroskop och Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Fastställande genuttryck profiler i C. elegans Använda Microarray och Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering av Kraniofaciala utveckling i sox10: Kaede Transgena Zebrafish Linje Använda Time-lapse konfokalmikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...