Name: rapid and efficient generation of neurons from human pluripotent stem cells in a multititre plate format
Uploaded: 2013-03-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Max Planck Society.

1. Fremstilling af Matrigelcoatede Plader og medier <ol><li> Fremstilling af Matrigel-overtrukne plader Matrigel har vist sig at være et foretrukket substrat for fastgørelse af differentiering EB&#39;er, og fremmer også en effektiv udvækst af neuroner fra disse 10. <ol><li> Thaw 10 ml Matrigel natten over på is. </li><li> Næste dag, fortyndes den geléagtige Matrigel med to volumener iskold DMEM/F-12 og forberede alikvoter af 1 ml i forafkølet 15 ml koniske rør, der kan opbevares frosne ved -20 ° C...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li><li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin.">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li><li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity.">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li><li>Greber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+inhibits+neural+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells.</a> EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).</li><li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene.">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293 (2011).</li></ol>

De fleste differentiering protokoller, der involverer EB dannelse fra hPSCs, herunder vores tidligere offentliggjorte procedure 10, er baseret på manuel eller enzym-assisteret høst af hESCs som aggregater, hvilket uundgåeligt fører til heterogenitet i EB størrelser. Dette forhold fører til variation i differentiering effektivitet med visse cellelinier, hvorved systematiske analyser vanskelig, især på et medium throughput skala. Desuden, manuel dissektion er arbejdskrævende som i sig selv bringer skal...

hPSCs omfattende embryo-afledte humane embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), er pluripotente forstand, at de kan give anledning til forskellige cellelinier in vitro 1-2. Talrige differentierede celletyper er afledt af hESCs til dato, støtter tanken om, at disse celler udgør værdifulde værktøjer til videnskabelig forskning og cellebaserede screeningsmetoder, og lovende for celle-baserede lægemidler. Neuronal differentiering protokoller for hESCs er sædvanligvis komplicerede og tidskrævende, da de ofte er baseret på første inducerende samlede neural skæbne, efterfulgt af manuel isolering af neurale progenitorceller og efterfølgende terminal differentiering til en bestemt neuron type interesse 3-6. I nogle henseende er denne kompleksitet ikke overraskende og uundgåelig i betragtning, at en sådan state-of-the-art rettet differentiering protokoller tendens til trinvis efterligner tidlig menneskelig udvikling, which er i sig selv meget kompleks. På den anden side kan det til dels også afspejler vores manglende forståelse af de underliggende molekylære processer, hvilket resulterer i differentiering protokoller, der stadig langt fra at være fuldt optimeret. Med hensyn til omdannelse af udifferentierede hPSCs i neuroectoderm, Pera et al. fundet, at suppression af BMP / SMAD1/5/8 signalering øger neural induktion af hESCs 7. Desuden har inaktivering af Smad2 / 3 signaleringen vist sig at fremme neuroectoderm dannelse 8. Følgelig kombineret inaktivering af disse to veje har tendens til at føre til mere effektiv neural induktion af hPSCs 4,9. Mere nyligt har vi vist, at en tredje signalvej, FGF / ERK, fungerer som en stærk repressor af de tidligste trin af neuroectodermal engagement i hESCs. Omvendt samtidig undertrykkelse af alle disse tre veje fører til nær-homogen konvertering af hESCs til neuroectoderm medpå bare fire dage 10. Efterfølgende blev højeffektive terminal differentiering i funktionelle neuroner observeret inden otte dage. De opnåede neuroner sandsynligvis ville være sensoriske neuroner i det perifere nervesystem, som delvist kan forklare deres hurtige afledning 10. Fejl i sensorisk neuron vedligeholdelse anses en årsag til visse menneskelige lidelser, såsom familiær dysautonomi 11. Til modellering af sådanne sygdomme baseret på hiPSC teknologi 12 for yderligere funktionel karakterisering, samt for anvendt formål, der ikke kræver nogen særlig type af neuroner, kan denne differentiering procedure fremlægge et brugbart grundlag. Men differentiering strategi, vi oprindelig ansat involveret dannelse af embryonale organer (EBS) fra klumper af hESC kolonier 10, og det resulterede i en ganske grad af heterogenitet med hensyn til EB størrelser, og syntes også at kompromittere neuron formation effektivitet i nogle cell linjer. Som følge af heterogeniteten i EB størrelser, evnen til systematisk at teste virkningerne af yderligere vækstfaktorer eller små molekyler under og efter neuron dannelse syntes at være noget forvirret. I denne rapport, tilpassede vi vores tidligere procedure til et medium throughput-kompatibel, tvungen aggregation-baseret teknik til generering EB&#39;er i en meget størrelse-kontrolleret måde, som også er vist i andre sammenhænge 13. Efterfølgende EBS genereret i V-formede brønde i plader med 96 brønde blev overført til U-formet ultra-low fastgørelse 96-brøndsplader, at indlede neuroectoderm dannelse i suspension. Fire dage senere kunne EB&#39;er blive udpladet give anledning til terminalt differentierede neuroner ved høj effektivitet og homogenitet. Alternativt var dag-4 EB&#39;er dissocieret til enkelte celler og udpladet som sådan, hvilket resulterede i lav massefylde monolag af humane neuroner. Sammenhængende resultater blev hidtil opnået med to uafhængigt deudledt hESC linjer, HuES6 og NCL3. Som en forudsætning, var vellykket EB formation strengt afhængig af anvendelsen af en syntetisk polymer, polyvinylalkohol (PVA), sammen med ROCK inhibitor Y-27632 kendt for at fremme hESC overlevelse 13-14. Som følge heraf dannes homogeniteten af ​​EB&#39;er i 96-V-plader blev i alt væsentligt forbedret i forhold til dannelsen af ​​EB&#39;er som massekulturer baseret på tilfældige opdeling teknikker. Dette system tilvejebringer således en væsentlig forbedret platform for neuroectoderm dannelse i suspensionskultur efterfulgt af nøje kontrolleret neuron formation under adhærerende betingelser.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 354.263 </td><td> Se tekst for detaljer om håndtering af </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Life Technologies </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> Poly (vinylalkohol) </td><td> Sigma </td><td> 363.170 </td><td> Opløses ved 0,4% i DMEM/F-12 anvendelse af et ultrasonisk vandbad / undgå overophedning / kan opbevares ved 4 ° C i flere uger </td></tr><tr><td> N2 Supplement </td><td> Life Technologies </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, opbevares som frosne portioner </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Life Technologies </td><td> 12587-010 </td><td> 50X, gem som frosne portioner </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, gem som frosne portioner </td></tr><tr><td> L-Glutamin med penicillin / streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-013 </td><td> Eller tilsvarende </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> Opløs ved 10 ug / ml i 0,1% BSA / PBS = 1000X, gem som frosne portioner </td></tr><tr><td> ROCK inhibitor Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-129 </td><td> Opløs ved 10 mM i DMSO = 1000X, gem som frosne portioner </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brønds V-bundede plader </td><td> Nunc </td><td> 277.143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> Axon Medchem </td><td> Axon 1408 </td><td> Opløses på 0,5 mM i DMSO = 1000X, gem som frosne portioner </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-163 </td><td> opløses ved 15 mM i DMSO = 1000X, gem som frosne portioner </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-200689 </td><td> opløses ved 0,5 mM i DMSO = 1000X, gem som frosne portioner </td></tr><tr><td> 96-brønds U-bundede ultralave monteringsbeslag </td><td> Corning </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> beta-III tubulin-antistof (mus) </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td> anvendelse ved 1:1000 </td></tr><tr><td> beta-III tubulin-antistof (kanin) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> anvendelse ved 1:2000 </td></tr><tr><td> BRN3A (POU4F1) antistof </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8429 </td><td> anvendelse på 1:500 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. &lt;/ Strong&gt; Specifikke reagenser og udstyr. </td></tr></tbody></table>

rapid and efficient generation of neurons from human pluripotent stem cells in a multititre plate format

Eksisterende protokoller til generering af neuroner fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) er ofte kedelig derved, at de er flertrinsprocesser, der involverer isolering og ekspansion af neurale precursorceller, før terminal differentiering. I forhold til disse tidskrævende metoder, har vi for nylig fundet, at kombineret hæmning af tre signalveje, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 og FGF / ERK, fremmer hurtig induktion af neuroectoderm fra hPSCs, efterfulgt af øjeblikkelig differentiering i funktionelle neuroner. Her har vi tilpasset vores procedure en hidtil ukendt multititre pladeformat, for yderligere at øge dens reproducerbarhed og for at gøre den forenelig med mid-throughput anvendelser. Det omfatter fire dages neuroectoderm dannelse i flydende kugler (embryoid organer), efterfulgt af yderligere fire dages differentiering i neuroner under adhærerende betingelser. De fleste celler opnået med denne protokol synes at være bipolære sensoriske neuroner. Endvidereproceduren er meget effektiv, kræver ikke særlige ekspert færdigheder, og er baseret på en simpel kemisk defineret medium med omkostningseffektive små molekyler. På grund af disse funktioner, kan proceduren tjene som en nyttig platform for yderligere funktionel undersøgelse samt for cellebaseret screening metoder, som kræver menneskelige sensoriske neuroner eller neuroner af enhver type.

I vores tidligere rapport, på linje med mange andre kunne EB&#39;er fra hPSCs genereres ved blot at genudpladning aggregater upon rutinemæssig opdeling af hPSCs i lav-vedhæftede retter 10. Dette resulterer som regel i en bred fordeling af resulterende EB størrelser (figur 1C, øverst). Et andet problem er resultatet af dette er, at EB&#39;er holdes i suspension har tendens til at aggregere med hinanden, hvilket fører til en endnu større heterogenitet EB størrelser. For at omgå disse p...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format at JoVE.com

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Protokoller for neuronal differentiering af pluripotente humane stamceller (hPSCs) er ofte tidskrævende og kræver væsentlige cellekultur færdigheder. Her har vi tilpasset et lille molekyle-differentiering procedure til en multititre pladeformat, hvilket tillader enkel, hurtig og effektiv produktion af humane neuroner på en kontrolleret måde.

Hurtig og effektiv generering af neuroner fra humane pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Udledning af menneskelige Hjerte prækursorer og cardiomyocytter fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generation of Human induceret pluripotente stamceller fra perifert blod Brug af STEMCCA lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Effektiv Sporulation af<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; I en 96 Multiwell format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv og konsistent generering af retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra menneskelige øjne til histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...