Name: the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli
Uploaded: 2013-01-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E.

Die Autoren danken den NIH (AI074224 und GM085323) und NSF (0.712.019 und 0.924.699) für die Finanzierung von Projekten gewidmet heterologen Biosynthese zu unterstützen.

Der Text ist spezifisch für das Antibiotikum Erythromycin A, aber die Schritte ausgebildet sind allgemein anwendbar auf andere natürliche Produkte als Kandidaten für heterologe Biosynthese. Ein. Erythromycin A Genetic Cluster Übertragung <ol><li> PCR-Primer-Design zu amplifizieren alle Gene mit dem Erythromycin A Cluster innerhalb des zugeordneten S. erythraea Chromosom. Dieser Schritt ist speziell auf diese Naturprodukt Kandidaten, deren genetische Sequenzen bestimmt wurden. ...

<ol>
	<li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products.">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li><li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+an+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea+for+stable+expression+of+the+Vitreoscilla+haemoglobin+gene+(vhb).">Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb).</a> Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modulation+of+the+overexpression+of+tailoring+genes+eryK+and+eryG+leading+to+the+improvement+of+erythromycin+A+purity+and+production+in+Saccharopolyspora+erythraea+fermentation.">Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation.</a> Appl. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+uptake+rate+optimization+with+nitrogen+regulation+for+erythromycin+production+and+scale-up+from+50+L+to+372+m3+scale.">Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale.</a> Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).</li><li>Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+options+for+the+heterologous+production+of+complex+natural+products.">Methods and options for the heterologous production of complex natural products.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).</li><li>Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. 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E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+complex+polyketides+in+a+metabolically+engineered+strain+of+E.+coli.">Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli.</a> Science. 291, 1790-1792 (2001).</li><li>Lee, H. Y., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay-guided+evolution+of+glycosylated+macrolide+antibiotics+in+Escherichia+coli.">Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli.</a> PLoS Biol. 5, e45 (2007).</li><li>Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli.">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li><li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products.">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li><li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering.">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li><li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host.">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li></ol>

2) biosynthetischen Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Critical Schritte in heterologen Biosynthese sind an jedem der drei Verfahrenssprachen Punkten im Prozess auftreten. Ein Problem in jedem Stadium wird entgleisen das ultimative Ziel der Schaffung heterologen Biosynthese. Vielleicht das schwierigste Aspekt des Verfahrens wird zur Festlegung rekonstituierten Biosynthese, da dies absolut notwendig ist, um erfolgreiche Analyse zu ermöglichen. Jedoch ist die Rekonstitution abhängig sorgfältige Plan...

Erythromycin A ist ein Antibiotikum Polyketid durch die Gram-positive Bodenbakterium Saccharopolyspora erythraea produziert und die laufende Produktion wurde schrittweise auf ~ 10 g / L durch jahrzehntelange traditionellen Mutagenese und Screening-Protokolle und neuerdings durch Prozessoptimierung Systeme 1-6 verbessert. Mutagenese und Screening-Strategien sind in antibiotischen Naturstoffen Produktentwicklung gemeinsame als Folge der Schwierigkeiten bei der Kultivierung und / oder genetisch manipuliert einheimische Produktion Hosts und wegen der leicht verfügbar antibiotische Aktivität oder verbesserte Wachstumsphänotypen zur Auswahl zu helfen. Im Fall von Erythromycin A, S. erythraea wird durch ein langsames Wachstum Profil und das Fehlen von mehr direkte genetische Manipulationsverfahren (bezogen auf Organismen wie E. coli) begrenzt somit behindern rasche Verbesserung der Produktionseffizienz und der Biosynthese von neuen Derivaten. Nachdem erkannte die Fragen der Produktion und entriegelt diversificatiüber die Möglichkeiten mit Verbindungen wie Erythromycin A, begann die Forschung, um die Idee von heterologen Biosynthese (Abbildung 1) 7 verfolgen. Diese Bemühungen fiel mit verfügbaren Sequenz für das Erythromycin A-Gencluster 8-11. Es sollte betont werden, dass die Zahl der sequenzierten komplexen Naturstoff Gencluster hat stark 12-16 erweitert werden und bietet den Anstoß für weitere Anstrengungen in heterologen Biosynthese kodiert medizinisches Potenzial zugreifen. Um dies zu tun, erfordert heterologen Rekonstitution, dass die neuen Host die Bedürfnisse der spezifischen Biosyntheseweg zu erfüllen. E. coli bietet technischen Komfort, eine breite umspannenden Reihe von Techniken der Molekularbiologie und Stoffwechsel-und Prozess-Engineering-Strategien für die Produktentwicklung. Doch wenn die einheimische Produktion Gastgeber, E. Vergleich coli zeigt nicht das gleiche Maß an komplexen Naturstoff Produktion. Es war daher nicht bekannt, ob E. coli konnte als eine tragfähige heterologen Option für komplexe Naturstoff-Biosynthese dienen. Es wurde jedoch angenommen, dass E. coli wäre eine ideale Wirtsorganismus sein, wenn heterologe Biosynthese erreicht werden könnte. Mit diesem Ziel im Hinterkopf, begann anfänglichen Bemühungen um die Polyketid-Aglykon 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) durch E. produzieren coli. Allerdings, native E. coli Stoffwechsel konnten keine nennenswerte Ebenen der Propionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA benötigt, um Vorstufen 6dEB Biosynthese unterstützt noch konnte der neue Host posttranslational modifizieren Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS) Enzyme. Um diese Probleme zu beheben, wurde ein Stoffwechselweg von nativen und heterologen Enzymen bestehen, in E. gebaut coli, so dass exogen zugeführten propionat intrazellulär wurde zu Propionyl-CoA überführt und anschließend (2S)-Methylmalonyl-CoA; im Engineering, um dieses Weges zu vervollständigen, wurde ein Gen in sfp th platzierte Chromosom von E. coli BL21 (DE3), um einen neuen Stamm zu produzieren genannt BAP1. Die Sfp Enzym ist ein Phosphopantetheinyl Transferase Lage der Befestigung der 4&#39;-Phosphopantethein Cofaktor den DEBS Enzyme 17,18. Die drei DEBS Gene (jeweils ~ 10 kb) wurden dann auf zwei separat wählbar Expressionsvektoren, induzierbare T7 Promotoren gestellt. Nach einer Einstellung des Schlüssels nach Induktion Temperatur (bis 22 ° C) wurden die DEBS Gene koordinativ innerhalb BAP1 in einem aktiven Zustand erzeugen kann 6dEB 19 exprimiert. Das Streben nach voller Erythromycin A-Biosynthese begann dann mit einem analogen Gencluster aus Micromonospora megalomicea oder ein hybrides Weg der Gene von S. zusammen erythraea, S. fradiae und S. venezuelae die Zwischenprodukte Erythromycin C und 6-deoxyerythromycin D, jeweils 20-22 produziert. Kürzlich hat unsere Fraktion diese Bemühungen durch die Herstellung erythrom verlängertycin A (die meisten klinisch relevanten Form von Erythromycin) durch E. coli. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten, unsere Strategie koordiniert äußerte die 20 original S. erythraea Gene für Polyketidbiosynthese, Desoxyzucker-Biosynthese und Befestigung, zusätzliche Anpassung und Selbst-Widerstand (Abbildung 2) benötigt. Insgesamt wurden 26 (native und heterolog) Gene entwickelt, damit E. coli zu Erythromycin A mit 4 mg / l 23,24 erzeugen. Dieses Ergebnis gegründet komplette Produktion eines komplexen Polyketid natürliches Produkt mit E. coli und dient als Grundlage zu nutzen, diese neue Produktion Option oder verfolgen neue.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> PCR-Maschine </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler personal </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Fischer </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Fischer </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpropionat </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-Arabinose </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Gekühlte Shaker </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> Zentrifuge 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Chaperone Plasmid Set (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF-Duet-1 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Ethylacetat </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrator 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Rotationsverdampfer </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

Die heterologe Produktion von komplexen Naturstoffen ist ein Ansatz entwickelt, um die jeweiligen Einschränkungen und zukünftigen Möglichkeiten anzugehen. Es ist besonders nützlich für solche Verbindungen, welche therapeutischen Wert besitzen, kann aber nicht ausreichend hergestellt waren oder aus einer verbesserten Form der Produktion profitieren. , 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Die experimentellen Verfahren beteiligt kann in drei Komponenten unterteilt werden. Jede experimentelle Komponente ist unter ständige Optimierung, um die Herausforderungen zu meistern und antizipieren die Chancen, die mit diesem neuen Ansatz verbunden. Heterologen Biosynthese beginnt mit der Identifikation einer genetischen Sequenz, die für wertvolle Naturprodukt. Übertragen dieser Sequenz mit einer heterologen Host wird durch den Biosyntheseweg Komplexität verantwortlich für die Produktentwicklung Bildung kompliziert. Das Antibiotikum Erythromycin A ist ein gutes Beispiel. Zwanzig Gene (in Höhe von&gt; 50 kb) sind für eventuelle Biosynthese erforderlich. Zusätzlich codieren drei dieser Gene Megasynthasen, Multi-Domain Enzyme jeweils ~ 300 kDa groß. Dieses genetische Material müssen so ausgelegt und übertragen werden E. coli für rekonstituierte Biosynthese. Die Verwendung der PCR Isolierung, Konstruktion Operon, Multi-cystronic Plasmiden und elektrooptischen Umwandlung wird bei der Übertragung der Erythromycin A bis E. genetischen Cluster beschrieben coli. Einmal übertragen, das E. coli Zelle muss unterstützt eventuelle Biosynthese. Dieser Prozess wird auch gegen die wesentlichen Unterschiede zwischen E. gegeben coli und originellsten Hosts verantwortlich komplexen Naturstoff Bildung. Die Zelle muss erforderlichen Substrate, um die Biosynthese unterstützen und koordinativ Ausdruck der übertragenen genetischen Cluster aktive Enzyme zu produzieren. Im Fall von Erythromycin A, das E. coli-Zelle musste entwickelt, um die beiden Vorstufen (pr liefernopionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA) für die Biosynthese erforderlich. Zusätzlich wurden Gensequenz Modifikationen Plasmidkopienzahl, Chaperonin Koexpression, posttranslationale enzymatische Modifikation und Prozesstemperatur auch erforderlich, damit endgültige Erythromycin A Formation. Schließlich muss eine erfolgreiche Produktion beurteilt werden. Für die Erythromycin Ein Fall, präsentieren wir zwei Methoden. Die erste ist Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion. Die Bioaktivität von Erythromycin A wird auch durch die Verwendung eines Bioassays, in dem der antibiotische Aktivität gegen Bacillus subtilis getestet wird bestätigt werden. Die Bewertungskriterien Assays etablieren Erythromycin A-Biosynthese aus E. coli und die Bühne für die zukünftige technische Anstrengungen zur Verbesserung oder Diversifizierung der Produktion und für die Herstellung neuer, komplexer Naturstoffe mit diesem Ansatz.

Das gewünschte Ergebnis dieses Ansatzes ist die Produktion eines vollständig bioaktiven Naturprodukt aus dem E. coli heterologe Wirt. Dies wird am besten durch die LC-MS-Ergebnisse verwendet, um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion (Abbildung 6) und die antibakterielle Bioassay zur endgültigen Aktivität zu bestätigen (Abbildung 7) dargestellt. In die allgemeine Systematik der heterologen Biosynthese, legt dieses Ergebnis Erfolg. Einmal erreicht, Forschungsanstre...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Das heterologe Biosynthese von Erythromycin A durch<em&gt; E. coli</em&gt; Enthält die folgenden experimentellen Schritte: 1) Übertragung genetischer Information, 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse. Jeder Schritt wird im Rahmen der Motivation, Potential und Herausforderungen bei der Herstellung von therapeutischen Naturprodukten mittels erläutert<em&gt; E. coli</em&gt; Als Surrogat-Host.

Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Research

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