Name: the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli
Uploaded: 2013-01-13T14:00:00
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저자는 heterologous 생합성에 전념 프로젝트를 지원하는 자금에 대한 NIH (AI074224 및 GM085323)와 NSF합니다 (0712019 및 0924699) 감사합니다.

아래의 텍스트는 에리스로 마이신 항생제에 대한 구체적인이지만, 단계 heterologous 생합성 후보와 같은 다른 천연 제품에 일반적으로 적용 할 수 있도록 설계되어 있습니다. 1. 에리스로 마이신 유전자 클러스터 전송 <ol><li> 디자인 PCR의 프리 머의 S. 내의 에리스로 마이신 클러스터와 관련된 유전자를 모두 증폭하는 erythraea의 염색체. 이 단계는 해당 유전자 시?...

<ol>
	<li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products.">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li><li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. 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G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli.">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li><li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products.">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li><li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. 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2) biosynthetic의 reconstitution; 3) 제품 분석 1) 유전자 전달 : heterologous 생합성에서 중요한 단계는 과정에서 세 절차 점의 각에 발생합니다. 어떤 단계에서 문제가 heterologous 생합성을 설립의 궁극적 인 목표를 탈선 것입니다. 이것은 절대적으로 성공적인 분석을 허용하는 데 필요한 있기 때문에 아마도 프로세스의 가장 어려운 부분은 재구성 생합성을 수립하고 있습니다. 그러나, reconstitution는 결국 생?...

에리스로 마이신은 그람 양성 토양 세균 Saccharopolyspora erythraea에 의해 생산 polyketide 항생제이며, 현재의 생산은 점차적으로 전통적인 mutagenesis 및 검사 프로토콜의 수십 년을 통해 그리고 더 최근의 프로세스 최적화를 구성 1-6으로 ~ 10g / L로 향상되었습니다. Mutagenesis 및 심사 전략은 배양 및 / 어려움의 결과로 또는 유전자 원시 생산 호스트를 조작하고 있기 때문에 즉시 사용할 수 항생제 활동이나 선택을 돕기위한 개선 된 성장 phenotypes의 항생제 천연 제품 개발에 일반적입니다. 에리스로 마이신 A, S.의 경우 erythraea의 생산과 새로운 파생 상품의 생합성에 빠른 개선을 hampering, 따라서 속도가 느린 성장 프로필과 더 직접적인 유전자 조작 기술의 부족 (대장균과 같은 미생물에 비해)에 의해 제한됩니다. 생산 문제를 인식하고 diversificati을 해제 갖는에리스로 마이신과 같은 화합물과 가능성에 연구 커뮤니티는 heterologous 생합성 (그림 1) 7의 아이디어를 추구하기 시작했다. 이러한 노력은 에리스로 마이신 유전자 클러스터 8-11에 사용할 수 시퀀스 정보를 동시에. 그것은 인코딩 의약 잠재력을 액세스 할 수 heterologous 생합성의 지속적인 노력이 원동력을 제공 순서가 복잡한 자연 제품 유전자 클러스터의 수가 크게 12-16을 확장했다 점을 강조해야합니다. 이렇게하려면 heterologous reconstitution는 새로운 호스트가 특정 biosynthetic 경로의 요구를 충족해야합니다. E.는 대장균은 기술의 편의를 분자 생물학 기술의 폭에 걸친 세트 및 제품 개발을위한 신진 대사 및 프로세스 엔지니어링 전략을 제공합니다. 그러나, 기본 생산 호스트, E.에 비해 대장균은 복잡한 자연 제품 생산의 동일한 수준을 전시하지 않습니다. 따라서 알려지지 않았다 E 여부. 대장균은 복잡한 자연 제품 생합성을위한 가능한 heterologous 옵션으로 제공 수 있습니다. 그러나, 가정이라고 E. heterologous 생합성을 수행 할 수 있다면 대장균은 이상적인 숙주 것입니다. 염두에두고이 목표로 초기 노력은 6 deoxyerythronolide B (6dEB) E. 통해 polyketide aglycone을 생산하기 시작 대장균. 그러나, 기본 E. 대장균의 신진 대사는 propionyl-COA의 감지 수준을 제공 할 수 없습니다 및 (2S) - methylmalonyl-COA의 전구체는 6dEB 생합성을 지원하기 위해하거나 새로운 호스트가 후 translationally deoxyerythronolide B의 synthase (DEBS) 효소를 수정할 수 있습니다 필요했습니다. 이러한 문제를 해결하려면 기본 및 heterologous 효소로 구성된 대사 경로는 E.에 내장 된 exogenously 자란 프로 피오 네이트는 (2S) - methylmalonyl-COA 후 propionyl-COA에 intracellularly 변환되었다는 등 대장균,이 경로를 완료 할 수있는 엔지니어링 동안은 SFP 유전자는 일에 배치되었습니다E.의 전자 염색체 새로운 변종을 생산하는 대장균 BL21 (DE3)는 BAP1를 칭했다. SFP 효소는 DEBS 효소 17,18에 4&#39;-phosphopantetheine cofactor을 첨부 phosphopantetheinyl transferase 할 수 있습니다. 세 DEBS 유전자는 (각 ~ 10 KB) 후 inducible T7의 추구를 포함하는이 별도로 선택 표현 벡터에 배치되었습니다. 포스트 유도 온도 (22 ° C까지)의 주요 조정 후, DEBS 유전자는 coordinately 6dEB 19 생성 할 수 활성 상태로 BAP1 내에서 표현되었다. 전체 에리스로 마이신을 추구하는 생합성 후 Micromonospora megalomicea에서 유사한 유전자 클러스터 나 S.의 유전자로 구성된 하이브리드 경로를 사용하기 시작 erythraea, S. fradiae, 그리고 S. 각각 중간체 에리스로 마이신 C, 6-deoxyerythromycin D, 20-22을 생산 venezuelae. 최근 우리 그룹은 erythrom을 생산하여 이러한 노력을 연장했습니다E. 통해 ycin A (에리스로 마이신의 가장 임상 적으로 관련성이 높은 양식) 대장균. 이전 작품에 대조적으로, 우리의 전략은 coordinately 20 원래 S.을 표현 erythraea 유전자는 polyketide 생합성, deoxysugar 생합성 및 첨부 파일 추가 조정하고, 자기 저항 (그림 2)에 필요한. 총 26 (기본 및 heterologous) 유전자는 E. 할 수 있도록 설계되었습니다 4 MG / L 23,24에서 에리스로 마이신을 생산하는 대장균. 이 결과는 E.를 사용하여 복잡한 polyketide 천연 제품의 전체 생산을 설립 대장균 및 활용이 새로운 생산 옵션을하거나 새를 추구에 기초 역할을합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> PCR 기계 </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler 개인 </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td> 어부 </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> 어부 </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 프로 피오 네이트 </td><td> 시그마 </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinose </td><td> 시그마 </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> 냉장 쉐이커 </td><td> 열 과학 </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Microfuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D를 원심 분리기 </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> 다카라 </td><td> 자야 플라스미드 세트 (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF - 듀엣-1 </td><td> EMD 화학 물질 </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 3200 Q-함정 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸 아세테이트 </td><td> 시그마 </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> 메타놀 </td><td> 시그마 </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 농축기 5301 </td><td></td></tr><tr><td> 로터리 증발기 </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

복잡한 자연 제품의 heterologous 생산은 현재 한계와 미래의 가능성을 해결하기위한 방법이다. 이 치료 가치를 가지고 있지만 충분히 생산 또는 생산의 개선 양식에서 도움이 될 수 없습니다 그 화합물에 특히 유용합니다. 2) heterologous reconstitution, 그리고 3) 제품 분석 1) 유전자 송금 : 관련 실험 절차는 세 가지 구성 요소로 세분화 할 수 있습니다. 각 실험 요소는 도전을 극복하고이 새로운 접근 방식과 관련된 기회를 예상 할 수 지속적인 최적화 아래에 있습니다. Heterologous 생합성는 귀중한 자연 제품에 대한 책임 유전자 시퀀스의 식별로 시작합니다. heterologous 호스트에이 시퀀스를 전송하는 것은 제품의 형성에 대한 책임 biosynthetic 경로의 복잡성에 의해 복잡합니다. 항생제 에리스로 마이신은 좋은 예입니다. 스물 유전자 ()&gt; 50킬로바이트 총은 결국 생합성 필요합니다. 또한,이 유전자의 세 크기는 megasynthases, 멀티 도메인 효소 각 ~ 300 kDa을 인코딩합니다. 이 유전 물질을 설계 및 E.로 이동해야합니다 재구성 생합성에 대한 대장균. PCR 절연, 오페론 건설, 멀티 cystronic plasmids 및 전기 변환의 사용은 에리스로 마이신에게 E.에 대한 유전자 클러스터를 전송하게 설명 될 것이다 대장균. 일단 양도, E. 대장균 세포는 결국 생합성을 지원해야합니다. 이 과정은 또한 E. 사이의 상당한 차이를 주어 도전합니다 대장균과 복잡한 자연 제품의 형성에 대한 책임 대부분의 원본 호스트. 세포는 생합성을 지원하기 위해 필요한 기판을 제공하고 coordinately 활성 효소를 생성하기 위해 전송 유전자 클러스터를 표현해야합니다. 에리스로 마이신 A, E.의 경우 대장균 세포는 두 전구체을 (PR 제공 할 수 있도록 설계해야했습니다opionyl-COA 및 (2S) - methylmalonyl-COA)은 생합성에 필요합니다. 또한, 유전자 시퀀스 수정, 플라스미드 복사 번호, chaperonin 공동 표현, 사후 병진 효소 수정, 및 프로세스 온도는 최종 에리스로 마이신에게 형성 할 수 있도록해야했다. 마지막으로, 성공적인 생산은 평가해야합니다. 에리스로 마이신 경우를 들어, 우리는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째는 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (LC-MS)가 생산을 확인하고 정량화하는 것입니다. 에리스로 마이신의 bioactivity는 또한 항생제 활동이 세균의 subtilis에 대한 테스트되는 bioassay의 사용을 통해 확인합니다. E.에서 에리스로 마이신을 설정 평가 assays는 생합성 생산을 향상 다양 화하는 미래의 엔지니어링 노력이 접근 방식을 사용하여 새 복잡한 자연 화합물의 생산을위한 무대를 대장균 등을 설정합니다.

이 방법의 원하는 결과는 E.에서 완전히 bioactive 천연 제품의 생산입니다 호스트 heterologous 대장균. 이것은 가장 생산 (그림 6)과 (그림 7) 최종 작업을 확인하는 데 사용되는 항균 bioassay을 확인하고 정량화하는 데 사용되는 LC-MS 결과로 표시됩니다. heterologous 생합성의 전체 구조에서이 결과는 성공을 정의합니다. 일단 달성, 연구 노력은 다음 최적화 (모두 휴대 전화 및 공?...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

을 통해 에리스로 마이신의 heterologous 생합성<em&gt; E. 대장균</em2) heterologous reconstitution, 그리고 3) 제품 분석 1) 유전자 전달 :&gt; 다음 실험 단계가 포함되어 있습니다. 각 단계는 사용하는 치료 천연 제품을 생산 동기 부여, 잠재적 인, 그리고 도전의 맥락에서 설명 될 것이다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 대리 호스트로.

을 통해 생산 단지 항생제 에리스로 마이신을 자랑하는 논리, 실험 단계, 그리고 Heterologous 자연 제품 생합성의 잠재적<em&gt; E. 대장균</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

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Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

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인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

사이트 특정 복제 막힘의 유도<i&gt; E. 대장균</i&gt; 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...