Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (CHE-0749737). وقدمت استخدام أداة من مرفق الطيف الكتلي في جامعة المحيط الهادئ.</p

1. إعداد نموذج حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أول الحلول الأسهم من الببتيد والأحماض إشارة ستة باستخدام مذيب مختلطة من الميثانول والماء في نسبة حجم 1:1. ينبغي الحلول الأوراق المالية لديها تركيز من حوالي 10 -3 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

يعتمد نجاح عملية القياس من الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد إلى حد كبير على اختيار الأحماض إشارة مناسبة. الأحماض مرجعية مثالية هي مركبات عضوية مماثلة هيكليا مع القيم الحموضة في مرحلة غاز راسخة. يجب أن يكون الأحماض إشارة هياكل مشابهة لبعضها البعض. وسيضمن هذا الكون مماث...

والحموضة من مخلفات الأحماض الأمينية هي من بين أهم خصائص الحراري التي تؤثر على الهياكل، والتفاعل، وعمليات قابلة للطي تتكشف من البروتينات 9،19. فرد مخلفات الأحماض الأمينية غالبا ما تظهر الحموضة فعالة مختلفة اعتمادا على مواقعها في البروتينات. على وجه الخصوص، بقايا تقع في المواقع المفعلة غالبا ما تظهر قلق كبير الحموضة. أحد الأمثلة على ذلك هو بقايا السيستين المقيمين في المواقع المفعلة من thioredoxin فائقة عائلة من الإنزيمات 20،21. السيستين موقع نشط هو الحمضية بشكل غير عادي مقارنة مع تلك الموجودة في تكشفت البروتينات 3-5. وقد اقترح أن التشكل حلزونية قد يكون لها مساهمة كبيرة في الحموضة غير عادية. وهناك دراسات تجريبية واسعة النطاق على خصائص حمض قاعدة من الببتيدات التي نفذت في الحلول، خاصة في المحاليل المائية 2،6-8. في كثير من الأحيان معقدة النتائج وفقا لتأثيرات المذيب7. في الواقع، تقع معظم المواقع المفعلة في البروتينات بالقرب من المنطقة الداخلية حيث يتم الحد من آثار المذيب 9،10. من أجل فهم جوهري خصائص حمض قاعدة من الببتيدات والبروتينات، فمن المهم إجراء الدراسات في بيئة خالية من المذيبات. ونحن هنا نقدم طريقة الشامل القائم على قياس الطيف لتحديد الحموضة في مرحلة غاز. ويشار إلى نهج مثل الطباخون الموسعة طريقة الحركية. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لمجموعة واسعة من أنظمة الكيميائية لتحديد الخصائص المختلفة الحراري، مثل الحموضة طور الغاز، تقارب بروتون، أيون تقارب المعدن، تقارب الإلكترون، وطاقة التأين 11-15، 22-26. لقد طبقنا هذا الأسلوب لتحديد الحموضة في مرحلة غاز من سلسلة من بنسبة ضئيلة السيستين والسيستين polyalanine-polyglycine الببتيدات 17،18،27. وتبين هذه الدراسات أن السيستين N-محطة peptidES بشكل ملحوظ أكثر حمضية من المقابلة منها محطة سي. والحموضة عالية من السابق ومن المرجح نتيجة لآثار متعلق بتكوين حلزونية التي استقرت بقوة أنيون thiolate عن التفاعل مع الحلزون، ثنائي القطب الماكرو. بسبب الطبيعة غير متقلبة، وقابل للتغيير حراريا من الببتيدات، وطريقة الحركية هو النهج الأكثر عملية المتاحة في الوقت الحاضر لإنتاج حمض قاعدة كميات دقيقة بشكل معقول الحراري من الببتيدات 28. ويبين المخطط العام والمعادلة المرتبطة مع أسلوب الحركية في الشكل 1. تحديد الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد (ه) يبدأ مع تشكيل سلسلة من الأنيونات كتلة البروتون محدد، [A • H • A ط] ¯ (أو [A ¯ • H + A • ط ¯] ¯)، في المنطقة مصدر أيون من مطياف الكتلة، حيث A ¯ ط ¯ وA هي الأشكال deprotonated من الببتيد والأحماض المرجعية، على التوالي. الأحماض المرجعية هي مركبات عضوية مع المعروف الحموضة في مرحلة غاز. يجب أن يكون الأحماض إشارة هياكل مشابهة لبعضها البعض (ولكن ليس بالضرورة مماثلة لتلك التي من الببتيد). التشابه في الهياكل بين الأحماض إشارة يضمن التشابه في الانتروبيا من نزع بروتون فيما بينها. الكتلة بروتون محدد ويتم اختيار كتلة الأنيونات والمفعلين يمكنهم collisionally وفصلها في وقت لاحق باستخدام الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) تجارب لتسفر عن الأنيونات أحادى المقابلة، A ¯ ط ¯ A و، مع ثوابت معدل K و k الأول، على التوالي، كما هو موضح في الشكل 1A. إذا الشظايا الثانوية تكاد لا تذكر، ونسبة وفرة من الأيونات شظية CID، [A ¯] / [A ط ¯]، يمثل تدبيرا تقريبي لنسبة من الثوابت معدل، ك / ك ط. تحت افتراض أنه لا توجد activat العكسيالحواجز أيون لكلتا القناتين التفكك، وايون المنتج CID المتفرعة النسب، LN [A ¯] / [A ط ¯]، سيتم ارتباطا خطيا إلى الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد (Δ حمض H) وتلك من الأحماض المرجعية (Δ حمض H I)، كما هو مبين في الشكل 1B. في هذه المعادلة، Δ H حمض المتوسط ​​هو متوسط ​​الحموضة في مرحلة غاز من الأحماض المرجعية، Δ (Δ S) هو مصطلح الكون (والتي يمكن افتراض ثبات إذا الأحماض المرجعية هي هيكليا مشابهة لبعضها البعض)، R هو ثابت الغاز العالمي، وT EFF هي درجة الحرارة الفعال للنظام. درجة الحرارة الفعالة هي معلمة التجريبية التي تعتمد على العديد من المتغيرات التجريبية، بما في ذلك الطاقة الاصطدام. يتم تحديد قيمة الحموضة طور الغاز عن طريق بناء مجموعتين من المؤامرات الحرارية الحركية. المجموعة الأولى هي OBيعتقلون من قبل بالتآمر LN ([A ¯] / [A ط ¯]) ضد Δ حمض H I - Δ H حمض المتوسط، كما هو مبين في الشكل 4A. سوف الانحدار الخطي تسفر عن مجموعة من الخطوط المستقيمة مع منحدرات X = 1 / RT EFF وقراءتها من Y = - [Δ حمض H - H Δ حمض المتوسط] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. يتم الحصول على المجموعة الثانية من المؤامرات من قبل المتهم بالتآمر في قراءتها الناتج (Y) من المجموعة الأولى ضد المنحدرات المقابلة (X)، كما هو مبين في الشكل 4B. الانحدار الخطي ينتج الخط الجديد مع منحدر من حمض H Δ - Δ H حمض المتوسط ​​واعتراض من Δ (Δ S) / R. ثم يتم الحصول على قيمة Δ حمض H من المنحدر ويتم الحصول على مصطلح الكون، Δ (Δ S)، منالتقاطع. وتجرى التجارب باستخدام الثلاثي مطياف الكتلة رباعي ربطه إلى التأين electrospray (ESI) مصدر أيون. ويظهر رسم تخطيطي للمطياف الكتلة في الشكل 2. وتجرى التجارب CID عن طريق اختيار كتلة كتلة البروتون الأنيونات محدد مع وحدة رباعي الأولى والسماح لهم الخضوع الاصطدامات مع ذرات الأرجون تسربت الى غرفة الاصطدام الذي يقام تحت ضغط من نحو 0.5 mTorr. يتم تحليل أيونات المنتج التفكك الشامل مع وحدة رباعي الثالث. وتسجل أطياف CID في العديد من الطاقات تصادم مع م / ض مجموعة واسعة بما يكفي لتغطية جميع أجزاء الثانوي ممكن. يتم قياس شدة CID ايون المنتج عن طريق وضع الصك في رصد رد فعل المختارة (SRM) الوضع الذي يركز الفحص على أيونات المنتج المحدد. يتم تنفيذ التجارب في إدارة البحث الجنائي أربعة طاقات تصادم مختلفة، المقابلة لالطاقات الوسط من الكتلة (E سم) من 1.0، 1.5، 2.0، و 2.5 فولت، على التوالي. يتم حساب الطاقة الوسط من الكتلة باستخدام المعادلة: E = E سم مختبر [م / (م + م)]، حيث E هي الطاقة مختبر تصادم في إطار المختبر، M هي كتلة من الأرجون، وM هو كتلة أيون كتلة البروتون منضم. في هذه المقالة، ونحن نستخدم علاء قليل الببتيد 3 CysNH 2 (A 3 CH) مثل مجمع نموذج. للمحطة سي هو amidated وسوف مجموعة ثيول (SH) من بقايا السيستين يكون موقع الحمضية. اختيار الأحماض إشارة مناسبة هو أمر حاسم لنجاح عملية القياس من الحموضة في مرحلة غاز. الأحماض مرجعية مثالية من الناحية الهيكلية مماثلة (لبعضها البعض) المركبات العضوية مع القيم الحموضة في مرحلة غاز راسخة. يجب أن يكون الأحماض مرجع قيم الحموضة قريب من الببتيدات. لالببتيد A 3 CH، ستة المهلجنة carboxyliويتم اختيار الأحماض C كما على الأحماض المرجعية. الأحماض إشارة ستة هي حمض الكلوروأسيتيك (MCAH)، bromoacetic حمض (مباه)، وحمض difluoroacetic (DFAH)، وحمض dichloroacetic (DCAH)، وحمض dibromoacetic (DBAH)، وtrifluoroacetic (TFAH). اثنين منهم، وسوف تستخدم DFAH ومباه، لتوضيح البروتوكول.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

مخلفات الأحماض الأمينية الموجودة في مواقع مختلفة في البروتينات مطوية في كثير من الأحيان تظهر درجات مختلفة من الحموضة. على سبيل المثال، بقايا السيستين التي تقع في أو بالقرب من N-محطة من الحلزون غالبا ما يكون أكثر حمضية من أنه في أو بالقرب من محطة سي 1-6. على الرغم من أن الدراسات التجريبية واسعة النطاق على خصائص حمض قاعدة من الببتيدات نفذت في المرحلة الموجزة، لا سيما في المحاليل المائية 6-8، وغالبا ما معقدة النتائج والآثار المذيبات 7. في الواقع، تقع معظم المواقع المفعلة في البروتينات بالقرب من المنطقة الداخلية حيث تم التقليل من آثار المذيب 9،10. من أجل فهم جوهري خصائص حمض قاعدة من الببتيدات والبروتينات، فمن المهم لاجراء الدراسات اللازمة في بيئة خالية من المذيبات. فإننا نقدم وسيلة لقياس الحموضة من oligopeptides في طور الغاز. ونحن نستخدم السيستين التي تحتوي على قليل الببتيد، علاء 3 CysNH <sUB&gt; 2 (CH A 3)، ومجمع نموذج. وتستند القياسات على الطباخون الموسعة طريقة الحركية راسخة (الشكل 1) 11-16. وتجرى التجارب من استخدام مطياف الكتلة الثلاثي رباعي ربطه مع التأين electrospray (ESI) مصدر أيون (الشكل 2). لكل عينة الببتيد، ويتم اختيار العديد من الأحماض المرجعية. الأحماض المرجعية هي مركبات عضوية مماثلة هيكليا مع المعروف الحموضة في مرحلة غاز. يتم إدخال محلول من خليط من الببتيد وحمض إشارة إلى مطياف الكتلة، ويتم تشكيل كتلة الأيونية متجهة بروتون A-الطور الغازي من حمض الببتيد المرجعية. والكتلة بروتون متجهة معزولة الشامل ومجزأة في وقت لاحق عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) التجارب. ويتم تحليل الناتج وفرة أيون شظية باستخدام العلاقة بين الحموضة والكتلة أيون تفارق حركية. الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد هو ثم obtaiNED بواسطة الانحدار الخطي من المؤامرات الحرارية الحركية 17،18. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمجموعة متنوعة من الأنظمة الجزيئية، بما في ذلك المركبات العضوية، والأحماض الأمينية ومشتقاتها، أليغنوكليوتيد]، وoligopeptides. بمقارنة الحموضة في مرحلة غاز تقاس تجريبيا مع تلك القيم المحسوبة لالمتشاكلات المختلفة، والآثار بتكوين جزئي على الحموضة يمكن تقييمها.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم التجارب بين أقواس CID معلومات عن الحموضة النسبية للالببتيد مقارنة مع الأحماض المرجعية المختارة. وترد اثنين من أطياف CID ممثل الببتيد (A 3 CH) مع اثنين من الأحماض المرجعية، DFAH ومباه، في الشكل 3. في 3A الشكل وفرة أيون (ذروة الارتفاع) ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

يوصف تحديد الحموضة في مرحلة غاز من oligopeptides تحتوي على السيستين. وتجرى التجارب باستخدام الثلاثي مطياف الكتلة رباعي. يتم قياس الحموضة النسبية للالببتيدات باستخدام الاصطدام الناجم عن التجارب التفكك، ويتم تحديد الحموضة الكمي باستخدام الطباخون الموسعة طريقة الحركية.

تحديد الحموضة في مرحلة غاز من Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

السريع إنتاجية عالية أميلوز تحديد في تجميد المجفف عينات درنة البطاطس

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

تشكيل الهياكل الجزيئية البيولوجية أمرت قبل التجميع الذاتي من الببتيدات قصير

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

تحديد المجموعات الوظيفية الكربونيل في بيو الزيوت التي كتبها الجهدية المعايرة: أسلوب Faix

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

تحديد الخواص الحرارية للسبائك المعدنية الأرض قلوية السائل باستخدام تقنية القوة الدافعة الكهربائية

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

مقدر ألياف الاراميد كوبوليمر قوة عالية لتمكين تحديد خواصها الميكانيكية

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

التوليف وتصميم هيكل الايزومرات بييا μ-كونوتوكسين مع Connectivities ثنائي كبريتيد مختلفة

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides