Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (CHE-0749737). وقدمت استخدام أداة من مرفق الطيف الكتلي في جامعة المحيط الهادئ.</p

1. إعداد نموذج حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أول الحلول الأسهم من الببتيد والأحماض إشارة ستة باستخدام مذيب مختلطة من الميثانول والماء في نسبة حجم 1:1. ينبغي الحلول الأوراق المالية لديها تركيز من حوالي 10 -3 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

يعتمد نجاح عملية القياس من الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد إلى حد كبير على اختيار الأحماض إشارة مناسبة. الأحماض مرجعية مثالية هي مركبات عضوية مماثلة هيكليا مع القيم الحموضة في مرحلة غاز راسخة. يجب أن يكون الأحماض إشارة هياكل مشابهة لبعضها البعض. وسيضمن هذا الكون مماث...

والحموضة من مخلفات الأحماض الأمينية هي من بين أهم خصائص الحراري التي تؤثر على الهياكل، والتفاعل، وعمليات قابلة للطي تتكشف من البروتينات 9،19. فرد مخلفات الأحماض الأمينية غالبا ما تظهر الحموضة فعالة مختلفة اعتمادا على مواقعها في البروتينات. على وجه الخصوص، بقايا تقع في المواقع المفعلة غالبا ما تظهر قلق كبير الحموضة. أحد الأمثلة على ذلك هو بقايا السيستين المقيمين في المواقع المفعلة من thioredoxin فائقة عائلة من الإنزيمات 20،21. السيستين موقع نشط هو الحمضية بشكل غير عادي مقارنة مع تلك الموجودة في تكشفت البروتينات 3-5. وقد اقترح أن التشكل حلزونية قد يكون لها مساهمة كبيرة في الحموضة غير عادية. وهناك دراسات تجريبية واسعة النطاق على خصائص حمض قاعدة من الببتيدات التي نفذت في الحلول، خاصة في المحاليل المائية 2،6-8. في كثير من الأحيان معقدة النتائج وفقا لتأثيرات المذيب7. في الواقع، تقع معظم المواقع المفعلة في البروتينات بالقرب من المنطقة الداخلية حيث يتم الحد من آثار المذيب 9،10. من أجل فهم جوهري خصائص حمض قاعدة من الببتيدات والبروتينات، فمن المهم إجراء الدراسات في بيئة خالية من المذيبات. ونحن هنا نقدم طريقة الشامل القائم على قياس الطيف لتحديد الحموضة في مرحلة غاز. ويشار إلى نهج مثل الطباخون الموسعة طريقة الحركية. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لمجموعة واسعة من أنظمة الكيميائية لتحديد الخصائص المختلفة الحراري، مثل الحموضة طور الغاز، تقارب بروتون، أيون تقارب المعدن، تقارب الإلكترون، وطاقة التأين 11-15، 22-26. لقد طبقنا هذا الأسلوب لتحديد الحموضة في مرحلة غاز من سلسلة من بنسبة ضئيلة السيستين والسيستين polyalanine-polyglycine الببتيدات 17،18،27. وتبين هذه الدراسات أن السيستين N-محطة peptidES بشكل ملحوظ أكثر حمضية من المقابلة منها محطة سي. والحموضة عالية من السابق ومن المرجح نتيجة لآثار متعلق بتكوين حلزونية التي استقرت بقوة أنيون thiolate عن التفاعل مع الحلزون، ثنائي القطب الماكرو. بسبب الطبيعة غير متقلبة، وقابل للتغيير حراريا من الببتيدات، وطريقة الحركية هو النهج الأكثر عملية المتاحة في الوقت الحاضر لإنتاج حمض قاعدة كميات دقيقة بشكل معقول الحراري من الببتيدات 28. ويبين المخطط العام والمعادلة المرتبطة مع أسلوب الحركية في الشكل 1. تحديد الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد (ه) يبدأ مع تشكيل سلسلة من الأنيونات كتلة البروتون محدد، [A • H • A ط] ¯ (أو [A ¯ • H + A • ط ¯] ¯)، في المنطقة مصدر أيون من مطياف الكتلة، حيث A ¯ ط ¯ وA هي الأشكال deprotonated من الببتيد والأحماض المرجعية، على التوالي. الأحماض المرجعية هي مركبات عضوية مع المعروف الحموضة في مرحلة غاز. يجب أن يكون الأحماض إشارة هياكل مشابهة لبعضها البعض (ولكن ليس بالضرورة مماثلة لتلك التي من الببتيد). التشابه في الهياكل بين الأحماض إشارة يضمن التشابه في الانتروبيا من نزع بروتون فيما بينها. الكتلة بروتون محدد ويتم اختيار كتلة الأنيونات والمفعلين يمكنهم collisionally وفصلها في وقت لاحق باستخدام الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) تجارب لتسفر عن الأنيونات أحادى المقابلة، A ¯ ط ¯ A و، مع ثوابت معدل K و k الأول، على التوالي، كما هو موضح في الشكل 1A. إذا الشظايا الثانوية تكاد لا تذكر، ونسبة وفرة من الأيونات شظية CID، [A ¯] / [A ط ¯]، يمثل تدبيرا تقريبي لنسبة من الثوابت معدل، ك / ك ط. تحت افتراض أنه لا توجد activat العكسيالحواجز أيون لكلتا القناتين التفكك، وايون المنتج CID المتفرعة النسب، LN [A ¯] / [A ط ¯]، سيتم ارتباطا خطيا إلى الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد (Δ حمض H) وتلك من الأحماض المرجعية (Δ حمض H I)، كما هو مبين في الشكل 1B. في هذه المعادلة، Δ H حمض المتوسط ​​هو متوسط ​​الحموضة في مرحلة غاز من الأحماض المرجعية، Δ (Δ S) هو مصطلح الكون (والتي يمكن افتراض ثبات إذا الأحماض المرجعية هي هيكليا مشابهة لبعضها البعض)، R هو ثابت الغاز العالمي، وT EFF هي درجة الحرارة الفعال للنظام. درجة الحرارة الفعالة هي معلمة التجريبية التي تعتمد على العديد من المتغيرات التجريبية، بما في ذلك الطاقة الاصطدام. يتم تحديد قيمة الحموضة طور الغاز عن طريق بناء مجموعتين من المؤامرات الحرارية الحركية. المجموعة الأولى هي OBيعتقلون من قبل بالتآمر LN ([A ¯] / [A ط ¯]) ضد Δ حمض H I - Δ H حمض المتوسط، كما هو مبين في الشكل 4A. سوف الانحدار الخطي تسفر عن مجموعة من الخطوط المستقيمة مع منحدرات X = 1 / RT EFF وقراءتها من Y = - [Δ حمض H - H Δ حمض المتوسط] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. يتم الحصول على المجموعة الثانية من المؤامرات من قبل المتهم بالتآمر في قراءتها الناتج (Y) من المجموعة الأولى ضد المنحدرات المقابلة (X)، كما هو مبين في الشكل 4B. الانحدار الخطي ينتج الخط الجديد مع منحدر من حمض H Δ - Δ H حمض المتوسط ​​واعتراض من Δ (Δ S) / R. ثم يتم الحصول على قيمة Δ حمض H من المنحدر ويتم الحصول على مصطلح الكون، Δ (Δ S)، منالتقاطع. وتجرى التجارب باستخدام الثلاثي مطياف الكتلة رباعي ربطه إلى التأين electrospray (ESI) مصدر أيون. ويظهر رسم تخطيطي للمطياف الكتلة في الشكل 2. وتجرى التجارب CID عن طريق اختيار كتلة كتلة البروتون الأنيونات محدد مع وحدة رباعي الأولى والسماح لهم الخضوع الاصطدامات مع ذرات الأرجون تسربت الى غرفة الاصطدام الذي يقام تحت ضغط من نحو 0.5 mTorr. يتم تحليل أيونات المنتج التفكك الشامل مع وحدة رباعي الثالث. وتسجل أطياف CID في العديد من الطاقات تصادم مع م / ض مجموعة واسعة بما يكفي لتغطية جميع أجزاء الثانوي ممكن. يتم قياس شدة CID ايون المنتج عن طريق وضع الصك في رصد رد فعل المختارة (SRM) الوضع الذي يركز الفحص على أيونات المنتج المحدد. يتم تنفيذ التجارب في إدارة البحث الجنائي أربعة طاقات تصادم مختلفة، المقابلة لالطاقات الوسط من الكتلة (E سم) من 1.0، 1.5، 2.0، و 2.5 فولت، على التوالي. يتم حساب الطاقة الوسط من الكتلة باستخدام المعادلة: E = E سم مختبر [م / (م + م)]، حيث E هي الطاقة مختبر تصادم في إطار المختبر، M هي كتلة من الأرجون، وM هو كتلة أيون كتلة البروتون منضم. في هذه المقالة، ونحن نستخدم علاء قليل الببتيد 3 CysNH 2 (A 3 CH) مثل مجمع نموذج. للمحطة سي هو amidated وسوف مجموعة ثيول (SH) من بقايا السيستين يكون موقع الحمضية. اختيار الأحماض إشارة مناسبة هو أمر حاسم لنجاح عملية القياس من الحموضة في مرحلة غاز. الأحماض مرجعية مثالية من الناحية الهيكلية مماثلة (لبعضها البعض) المركبات العضوية مع القيم الحموضة في مرحلة غاز راسخة. يجب أن يكون الأحماض مرجع قيم الحموضة قريب من الببتيدات. لالببتيد A 3 CH، ستة المهلجنة carboxyliويتم اختيار الأحماض C كما على الأحماض المرجعية. الأحماض إشارة ستة هي حمض الكلوروأسيتيك (MCAH)، bromoacetic حمض (مباه)، وحمض difluoroacetic (DFAH)، وحمض dichloroacetic (DCAH)، وحمض dibromoacetic (DBAH)، وtrifluoroacetic (TFAH). اثنين منهم، وسوف تستخدم DFAH ومباه، لتوضيح البروتوكول.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

مخلفات الأحماض الأمينية الموجودة في مواقع مختلفة في البروتينات مطوية في كثير من الأحيان تظهر درجات مختلفة من الحموضة. على سبيل المثال، بقايا السيستين التي تقع في أو بالقرب من N-محطة من الحلزون غالبا ما يكون أكثر حمضية من أنه في أو بالقرب من محطة سي 1-6. على الرغم من أن الدراسات التجريبية واسعة النطاق على خصائص حمض قاعدة من الببتيدات نفذت في المرحلة الموجزة، لا سيما في المحاليل المائية 6-8، وغالبا ما معقدة النتائج والآثار المذيبات 7. في الواقع، تقع معظم المواقع المفعلة في البروتينات بالقرب من المنطقة الداخلية حيث تم التقليل من آثار المذيب 9،10. من أجل فهم جوهري خصائص حمض قاعدة من الببتيدات والبروتينات، فمن المهم لاجراء الدراسات اللازمة في بيئة خالية من المذيبات. فإننا نقدم وسيلة لقياس الحموضة من oligopeptides في طور الغاز. ونحن نستخدم السيستين التي تحتوي على قليل الببتيد، علاء 3 CysNH <sUB&gt; 2 (CH A 3)، ومجمع نموذج. وتستند القياسات على الطباخون الموسعة طريقة الحركية راسخة (الشكل 1) 11-16. وتجرى التجارب من استخدام مطياف الكتلة الثلاثي رباعي ربطه مع التأين electrospray (ESI) مصدر أيون (الشكل 2). لكل عينة الببتيد، ويتم اختيار العديد من الأحماض المرجعية. الأحماض المرجعية هي مركبات عضوية مماثلة هيكليا مع المعروف الحموضة في مرحلة غاز. يتم إدخال محلول من خليط من الببتيد وحمض إشارة إلى مطياف الكتلة، ويتم تشكيل كتلة الأيونية متجهة بروتون A-الطور الغازي من حمض الببتيد المرجعية. والكتلة بروتون متجهة معزولة الشامل ومجزأة في وقت لاحق عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) التجارب. ويتم تحليل الناتج وفرة أيون شظية باستخدام العلاقة بين الحموضة والكتلة أيون تفارق حركية. الحموضة في مرحلة غاز من الببتيد هو ثم obtaiNED بواسطة الانحدار الخطي من المؤامرات الحرارية الحركية 17،18. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمجموعة متنوعة من الأنظمة الجزيئية، بما في ذلك المركبات العضوية، والأحماض الأمينية ومشتقاتها، أليغنوكليوتيد]، وoligopeptides. بمقارنة الحموضة في مرحلة غاز تقاس تجريبيا مع تلك القيم المحسوبة لالمتشاكلات المختلفة، والآثار بتكوين جزئي على الحموضة يمكن تقييمها.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم التجارب بين أقواس CID معلومات عن الحموضة النسبية للالببتيد مقارنة مع الأحماض المرجعية المختارة. وترد اثنين من أطياف CID ممثل الببتيد (A 3 CH) مع اثنين من الأحماض المرجعية، DFAH ومباه، في الشكل 3. في 3A الشكل وفرة أيون (ذروة الارتفاع) ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

يوصف تحديد الحموضة في مرحلة غاز من oligopeptides تحتوي على السيستين. وتجرى التجارب باستخدام الثلاثي مطياف الكتلة رباعي. يتم قياس الحموضة النسبية للالببتيدات باستخدام الاصطدام الناجم عن التجارب التفكك، ويتم تحديد الحموضة الكمي باستخدام الطباخون الموسعة طريقة الحركية.

تحديد الحموضة في مرحلة غاز من Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

السريع إنتاجية عالية أميلوز تحديد في تجميد المجفف عينات درنة البطاطس

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

From Constructs to Crystals &amp;#8211; Towards Structure Determination of &amp;#946;-barrel Outer Membrane Proteins

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls cause an increase in viscosity (often referred to as &#39;aging&#39;) during storage of bio-oils. As such, carbonyl content has previously been used as a method of tracking bio-oil aging and condensation reactions with less variability than viscosity measurements. Additionally, carbonyls are also responsible for coke formation in bio-oil upgrading processes. Given the importance of carbonyls in bio-oils, accurate analytical methods for their quantification are very important for the bio-oil community. Potentiometric titration methods based on carbonyl oximation have long been used for the determination of carbonyl content in pyrolysis bio-oils. Here, we present a modification of the traditional carbonyl oximation procedures that results in less reaction time, smaller sample size, higher precision, and more accurate carbonyl determinations. While traditional carbonyl oximation methods occur at room temperature, the Faix method presented here occurs at an elevated temperature of 80 &#176;C.

Here we present a potentiometric titration technique for accurately quantifying carbonyl compounds in pyrolysis bio-oils.

تحديد المجموعات الوظيفية الكربونيل في بيو الزيوت التي كتبها الجهدية المعايرة: أسلوب Faix

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline earth-liquid metal alloys as functions of both composition and temperature in order to acquire thermodynamic data. The cell consists of a chemically stable solid-state CaF2-AF2 electrolyte (where A is the alkaline-earth element such as Ca, Sr, or Ba), with binary A-B alloy (where B is the liquid metal such as Bi or Sb) working electrodes, and a pure A metal reference electrode. Emf data are collected over a temperature range of 723 K to 1,123 K in 25 K increments for multiple alloy compositions per experiment and the results are analyzed to yield activity values, phase transition temperatures, and partial molar entropies/enthalpies for each composition.

This protocol describes the measurement of the electromotive force of alkaline-earth elements in liquid metal alloys at high temperatures (723-1,123 K) to determine their thermodynamic properties, including activity, partial molar entropy, partial molar enthalpy, and phase transition temperatures, over a wide composition range.

تحديد الخواص الحرارية للسبائك المعدنية الأرض قلوية السائل باستخدام تقنية القوة الدافعة الكهربائية

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

مقدر ألياف الاراميد كوبوليمر قوة عالية لتمكين تحديد خواصها الميكانيكية

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Synthesis and Structure Determination of &amp;#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

التوليف وتصميم هيكل الايزومرات بييا μ-كونوتوكسين مع Connectivities ثنائي كبريتيد مختلفة

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

تقنيات قياس الطيف الكتلي للتنقل من أيون لتحديد بنية وآليات التعرف على الأيون المعدني ونشاط الأكسدة من Oligopeptides التجليد المعدني

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Determination of the Photoisomerization Quantum Yield of a Hydrazone Photoswitch

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they are utilized in a wide variety of applications. In most studies employing photoswitches, several important photophysical properties such as maximum wavelengths of absorption and emission, molar attenuation coefficient, fluorescence lifetime, and photoisomerization quantum yield are carefully determined to investigate their electronic states and transition processes. However, measurement of the photoisomerization quantum yield, the efficiency of photoisomerization with respect to the absorbed photons, in a typical laboratory setting is often complicated and prone to error because it requires the implementation of rigorous spectroscopic measurements and calculations based on an appropriate integration method. This article introduces a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a bistable photoswitch using a photochromic hydrazone. We anticipate that this article will be a useful guide for the investigation of bistable photoswitches that are being increasingly developed.

Photoisomerization quantum yield is a fundamental photophysical property that should be accurately determined in the investigation of newly developed photoswitches. Here, we describe a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a photochromic hydrazone as a model bistable photoswitch.

تحديد العائد الكمومي للأيزومرات الضوئية ل Hydrazone Photoswitch

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they ...

تحليل المبيدات في الأفوكادو باستخدام طريقة QuEChERS و CG-MS / MS

Determination of 45 Pesticides in Avocado Varieties by the QuEChERS Method and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Gas chromatography (GC) tandem mass spectrometry (MS/MS) stands as a preeminent analytical instrument extensively employed for the surveillance of pesticide residues in food. Nevertheless, these methods are vulnerable to matrix effects (MEs), which can potentially affect accurate quantification depending on the specific combination of analyte and matrix. Among the various strategies to mitigate MEs, matrix-matched calibration represents the prevailing approach in pesticide residue applications due to its cost-effectiveness and straightforward implementation. In this study, a total of 45 representative pesticides were analyzed in three different varieties of avocado (i.e., Criollo, Hass, and Lorena) using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate and GC-MS/MS. 
For this purpose, 5 g of the avocado sample was extracted with 10 mL of acetonitrile, and then 2.5 g of ammonium formate was added to induce phase separation. Subsequently, the supernatant underwent a cleanup process via dispersive solid-phase extraction employing 150 mg of anhydrous MgSO4, 50 mg of primary-secondary amine, 50 mg of octadecylsilane, 10 mg of graphitized carbon black, and 60 mg of a zirconium oxide-based sorbent (Z-Sep+). The GC-MS/MS analysis was successfully performed in less than 25 min. Rigorous validation experiments were carried out to assess the performance of the method. The examination of a matrix-matched calibration curve for each variety of avocado revealed that the ME remained relatively consistent and less than 20% (considered as a soft ME) for most pesticide/variety combinations. Furthermore, the method&#180;s limits of quantification were lower than 5 &#181;g/kg for all three varieties. Finally, the recovery values for most pesticides fell within the acceptable range of 70-120%, with relative standard deviation values below 20%.

تحضير عينة الأفوكادو باستخدام طريقة QuEChERS مع فورمات الأمونيوم لتحليل المبيدات

The present protocol describes the analysis of multiclass pesticide residues in avocado varieties using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate, followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry.