Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Arbejdet blev støttet af National Science Foundation (CHE-0.749.737). Instrumentet forbrug blev leveret af massespektrometri Facility på University of the Pacific.</p

1.. Klargøring af prøven Solutions <ol><li> Først forberede stamopløsninger af peptidet og seks referencepunkter syrer ved hjælp af en blandet opløsningsmiddel af methanol og vand i et 1:1 volumenforhold. Stamopløsningerne bør have en koncentration på ca 10 -3 M. </li><li> Afvej 1 mg af den faste peptid prøve, A 3 CH, i et 1,5 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes 1,0 ml blandet opløsningsmiddel af methanol og vand, og blandes med en hvirvel. </li><li> Afvej 1 mg difluoreddikesyre (DFAH...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

Den vellykkede måling af gas-fase surhedsgrad af et peptid i høj grad baseret på udvælgelsen af ​​egnede referencepunkter syrer. Den ideelle reference-syrer er strukturelt lignende organiske forbindelser med veletablerede gasfaseeksperimenter surhedsgrad værdier. Referencetallene syrer bør have lignende strukturer til hinanden. Dette vil sikre en tilsvarende entropi deprotonering for hver referenceopløsning syrer i sættet. Referenceværdierne syrer skal have surhedsgrad værdier tæt på de af peptider. For ...

De syrer af aminosyrerester er blandt de vigtigste termokemiske egenskaber, der påvirker strukturer, reaktivitet, og den folde-udfoldning processer af proteiner 9,19. Individuelle aminosyrerester ofte viser forskellige effektive syrer afhængigt af deres placeringer i proteiner. Ofte især resterne placeret på de aktive steder udviser signifikant forstyrret syrer. Et sådant eksempel er cysteinresten bosiddende i de aktive steder af thioredoxin super-familie af enzymer 20,21. Den aktive sted cystein er usædvanligt sure sammenlignet med dem i udfoldede proteiner 3-5. Det er blevet foreslået, at den spiralformede konformation kan have et væsentligt bidrag til den usædvanlige syreindhold. Der er omfattende eksperimentelle undersøgelser af syre-base egenskaber af peptider udføres i opløsninger, især i vandige opløsninger 2,6-8. Resultaterne blev ofte kompliceret af solventeffekter7.. Faktisk er de fleste af de aktive steder i proteiner placeret nær den indre område hvor solventeffekter minimeres 9,10. For at forstå iboende syre-base egenskaber af peptider og proteiner, er det vigtigt at udføre undersøgelserne i et opløsningsmiddel-frit miljø. Her introducerer vi et massespektrometri-baseret metode til bestemmelse af den gas-fasen surhedsgrad. Den fremgangsmåde er benævnt udvidede Cooks kinetiske metode. Denne metode er blevet anvendt med succes til en bred vifte af kemiske systemer til bestemmelse af forskellige termokemiske egenskaber, såsom gas-fase syreindhold, proton affinitet, metalionen affinitet, elektron affinitet, og ioniseringsenergi 11-15, 22-26. Vi har anvendt denne metode til at bestemme gas-fase syrer af en serie af oligo cysteinholdige polyalanin og cystein-polyglycin peptider 17,18,27. Disse undersøgelser viser, at den N-terminale cystein peptides er betydeligt mere sure end de tilsvarende C-terminale dem. De høje syrer i det tidligere skyldes sandsynligvis de spiralformede konformationelle virkninger hvor thiolat anion kraftigt stabiliseret ved interaktion med helix makro-dipol. På grund af den ikke-flygtige og termisk labile karakter af peptider, er den kinetiske metode den mest praktiske fremgangsmåde til rådighed på nuværende tidspunkt at fremstille rimeligt nøjagtige syre-base termokemiske mængder af peptider 28. Den generelle opbygning og ligningen forbundet med den kinetiske metode er vist i figur 1.. Bestemmelsen af gas-fasen surhedsgrad et peptid (AH) starter med dannelsen af en række proton-bundne klynge anioner, [A • H • A i] ¯ (eller [A ¯ • H + • Ai ¯] ¯), i ionkilden region i massespektrometret, hvor A ¯ og A i ¯ er deprotonerede former af peptidet ogreference syrer, hhv. Referenceværdierne syrer er organiske forbindelser med kendte gas-fase syrer. Referencetallene syrer skal have strukturer, der svarer til hinanden (men ikke nødvendigvis svarer til peptidet). Ligheden mellem strukturer mellem reference-syrer sikrer ligheden mellem de entropier af deprotonation blandt dem. Proton-bundne klynge anioner masse udvalgt og collisionally aktiveret og derefter dissocieret ved hjælp kollision-induceret dissociation (CID) eksperimenter til opnåelse af de tilsvarende monomere anioner, A ¯ og A i ¯, med hastighedskonstanterne for k og k I, henholdsvis, er vist i figur 1a. Hvis sekundære fragmenteringer er ubetydelige, den overflod forholdet mellem CID fragmentioner, [A ¯] / [A i ¯], udgør et omtrentligt mål for forholdet mellem ratekonstanter, k / k I. Under den antagelse, at der ikke er omvendt aktiveretion barrierer for både dissociation kanaler, CID produkt ion forgreningsforhold, ln [A ¯] / [A i. ¯], vil blive lineært korreleret til gasfase-surhed af peptid (Δ syre H) og de ​​af reference-syrer (Δ syre H i), som vist i figur 1b. I denne ligning er Δ acid H avg den gennemsnitlige gas-fase surhedsgrad reference syrer, Δ (Δ S) er den entropi sigt (hvilket kan antages konstant, hvis reference syrer er strukturelt ligner hinanden), R er universel gas konstant, og T eff er den effektive temperatur af systemet. Den effektive temperatur er en empirisk parameter, der afhænger af flere eksperimentelle variabler, herunder kollisionen energi. Værdien af ​​gasfase-syreindhold bestemmes ved at konstruere to sæt termo-kinetiske plots. Det første sæt er obopretholdt ved at plotte ln ([A ¯] / [A i ¯]) mod Δ acid H i - Δ syre H avg, som vist i figur 4a. Lineær regression vil give et sæt af lige linjer med skråningerne af X = 1 / RT EFF og aflytninger af Y = - [Δ acid H - Δ acid H avg] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. Det andet sæt af grunde opnås ved at plotte de resulterende opfanger (Y) fra det første sæt mod de tilsvarende skråninger (X), som vist i figur 4b. Lineær regression producerer en ny linje med en hældning på Δ acid H - Δ acid H avg og en skæring med Δ (Δ S) / R. Værdien af Δ acid H opnås derefter fra hældningen og entropi sigt Δ (Δ S), fås fraskæringspunktet. Eksperimenterne udføres ved hjælp af en tripel kvadrupol massespektrometer grænseflader til en elektrospray (ESI) ionkilde. En skematisk diagram af massespektrometer er vist i figur 2.. De CID forsøg udføres efter masse at vælge proton-bundne klynge anioner med den første kvadrupol enheden og tillade dem at gennemgå kollisioner med argonatomer lækket ind kollisionen kammer, som holdes ved et tryk på omkring 0,5 mTorr. Dissociationen produkt ioner masse analyseres med den tredje quadrupol enheden. CID spektre optages på flere kollision energier med m / z interval bred nok til at dække alle mulige sekundære fragmenter. CID produkt ionintensiteter måles ved at sætte instrumentet i den valgte reaktion overvågning (SRM) tilstand, hvor scanningen er fokuseret på udvalgte produktområder ioner. CID eksperimenter udføres på fire forskellige kollision energier, svarende tilcenter-of-masse energi (E cm) på 1,0, 1,5, 2,0, og 2,5 eV, hhv. Centrum-of-masse energi beregnes ved ligning: E cm = E lab [m / (M + m)], hvor E lab er kollision energi i laboratoriet rammen, m er massen af argon og M er massen af ​​proton-bundne klynge ion. I denne artikel bruger vi oligopeptidet Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som model compound. C-terminalen er amideret, og thiolgruppe (SH) i cysteinresten vil være den sure side. Udvælgelsen af ​​egnede referenceprodukter syrer er afgørende for en vellykket måling af gas-fasen surhedsgrad. Den ideelle reference-syrer er strukturelt ligner (på hinanden) organiske forbindelser med veletablerede gasfaseeksperimenter surhedsgrad værdier. Referenceværdierne syrer skal have surhedsgrad værdier tæt på at af peptider. For peptid A 3 CH, halogenerede seks carboxylic syrer er valgt som reference syrer. De seks referencepunkter syrer er chloreddikesyre (MCAH), bromeddikesyre (MBAH), difluoreddikesyre (DFAH), dichloreddikesyre (DCAH), dibromoacetic syre (DBAH), og trifluoreddikesyre (TFAH). To af dem, vil DFAH og MBAH, anvendes til at illustrere protokollen.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Aminosyrerester placeret på forskellige positioner i foldede proteiner ofte udviser forskellige grader af syrer. For eksempel er en cysteinrest placeret ved eller nær N-terminalen af en helix ofte mere sure end ved eller nær C-terminalen 1-6. Selv omfattende eksperimentelle undersøgelser af syre-base egenskaber af peptider er blevet foretaget i den kondenserede fase, navnlig i vandige opløsninger 6-8, er resultaterne ofte kompliceret af solventeffekter 7. Faktisk er de fleste af de aktive steder i proteiner placeret nær den indre region, hvor opløsningsmiddel virkninger er blevet minimeret 9,10. For at forstå iboende syre-base egenskaber af peptider og proteiner, er det vigtigt at udføre undersøgelserne i et opløsningsmiddel-frit miljø. Vi præsenterer en metode til at måle syrer af oligopeptider i gasfase. Vi bruger en cystein-holdige oligopeptid, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (A 3 CH), som modelforbindelse. Målingerne er baseret på veletablerede udvidet Cooks kinetisk metode (Figur 1) 11-16. Forsøgene udføres under anvendelse af en triple-kvadrupol massespektrometer interface med en elektrospray (ESI) ionkilde (figur 2). For hvert peptid stikprøve flere referencepunkter syrer valgt. Referenceværdierne syrer er strukturelt lignende organiske forbindelser med kendte gas-fase syrer. En opløsning af blandingen af ​​peptidet og en reference syre indføres i massespektrometret, og en gas-fase proton-bundne anioniske klynge af peptid-henvisning Syren dannes. Proton-bundet cluster masse isoleres og efterfølgende fragmenteret via kollision-induceret dissociation (CID) eksperimenter. Det resulterende fragment ion mængderne er analyseret ved en relation mellem syrer og klyngen ion dissociation kinetik. Gasfase-surhedsgrad peptidet er derefter obtaiNed ved lineær regression af termo-kinetiske plots 17,18. Fremgangsmåden kan anvendes til en bred vifte af molekylære systemer, herunder organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, oligonukleotider og oligopeptider. Ved at sammenligne gas-fase syrer målt eksperimentelt med disse beregnede værdier for forskellige afarter kan konformationelle virkninger på syrer evalueres.

<ol><li> CID bracketing eksperimenter give oplysninger om de relative syrer af peptidet i forhold til de valgte referencestoffer syrer. To repræsentative CID spektre af peptidet (A 3 CH) med to reference syrer, DFAH og MBAH, er vist i figur 3.. I figur 3a ion overflod (tophøjde) af peptidet ion er svagere end DFA ¯, og i figur 3b, ion overflod af peptidet ion er stærkere end MBA ¯. De to spektre tyder på, at gasfase-surhedsgrad peptidet er i intervallet mellem syrer af disse to...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Fastsættelsen af ​​gas-fase syrer af cystein-holdige oligopeptider beskrives. Eksperimenterne udføres ved hjælp af en tripel kvadrupol massespektrometer. De relative syrer af peptiderne måles ved hjælp kollision-induceret dissociation eksperimenter, og de kvantitative syrer bestemmes ved hjælp af de udvidede Cooks kinetisk metode.

Bestemmelse af gas-fase syrer af Oligopeptider

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid High Throughput Amylose Bestemmelse i frysetørret kartoffelknolden Prøver

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse af Bestilte Biomolekylær Strukturer af Self-samling af korte peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

Fra konstruktioner på Crystals - Mod Structure Bestemmelse af β-tønde ydermembranproteiner

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese af Protein biokonjugater<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Kemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Bestemmelse af carbonylfunktionelle grupper i Bio-olier ved potentiometrisk titrering: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

Bestemmelse af termodynamiske egenskaber af Alkaline jord-væske metallegeringer ved hjælp af elektromotoriske kraft teknik

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Udrede højstyrke Copolymer Aramid fibre til bestemmelse af mekaniske egenskaber

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Syntese og struktur bestemmelse af µ-Conotoxin PIIIA isomerer med forskellige disulfid Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ion Mobility-massespektrometri teknikker til bestemmelse af strukturen og mekanismerne for metal Iongenkendelse og Redoxaktivitet af metal bindende oligopeptider