Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מל&quot;ג-0,749,737). השימוש במכשיר סופק על ידי המתקן המוני ספקטרומטריית באוניברסיטה של ​​האוקיינוס ​​השקט.</p

1. הכנה של פתרונות לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשון להכין את פתרונות המניות של הפפטיד ואת חומצות התייחסות לשש מעורב בשימוש בממס של מתנול ומים ביחס נפח של 1:1. את פתרונות המניות צריכים להיות בריכוז של כ -10 מ &#39;-3 </li><li style=";text-align:right;direction:...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

המדידה המוצלחת של חומציות גז השלב של פפטיד מסתמכת במידה רבה על הבחירה של חומצות התייחסות מתאימות. חומצות התייחסות האידיאליות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה. זה יבטיח אנטרופיה דומה של...

את acidities של שאריות חומצת אמינו הוא בין המאפיינים החשובים ביותר המשפיעים על thermochemical מבנים, תגובתיות, והתהליכים שהתרחש קיפול של חלבונים 9,19. שאריות חומצת אמינו בודדות לעתים קרובות להראות acidities היעיל שונה בהתאם למיקומם בחלבונים. בפרט, את השאריות הנמצאות באתרים הפעילים מפגינות לעתים קרובות מוטרד acidities באופן משמעותי. דוגמה אחת כזו היא שאריות ציסטאין המתגוררים באתרים הפעילים של סופר המשפחה של אנזימי thioredoxin 20,21. ציסטאין האתר הפעיל הוא חומצי במיוחד בהשוואה לאלו בפרשו חלבונים 3-5. היה מי שהציע שקונפורמציה הסליל יכולה להיות תרומה משמעותית לחומציות יוצאת דופן. ישנם מחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים שבוצעו בפתרונות, בעיקר בתמיסות מימיות 2,6-8. התוצאות לעתים קרובות היו מסובכות על ידי אפקטי ממס7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס הם מזעריים 9,10. על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע את המחקרים בסביבה נטולת ממס. כאן אנו מציגים שיטה המבוססת על ספקטרומטריית מסה לקביעת חומציות גז השלב. הגישה שמכונה שיטה הקינטית המורחבת טבחים. שיטה זו יושמה בהצלחה במגוון רחב של מערכות כימיות לזיהוי תכונות thermochemical שונים, כגון חומציות גז השלב, זיקת הפרוטון, זיקת יון המתכת, זיקה האלקטרונית, ואנרגיה יינון 11-15, 22-26. יש לנו ליישם שיטה זו על מנת לקבוע את acidities גז השלב של סדרה של אוליגו ציסטאין-polyalanine וציסטאין-polyglycine פפטידים 17,18,27. מחקרים אלה מראים כי ציסטאין N-מסוף peptidES באופן משמעותי יותר חומצי מאלה C-המסוף המתאימים. את acidities הגבוהות של לשעבר צפוי בשל השפעות קונפורמציה הסליל שבי אניון thiolate הוא התייצב בחום על ידי האינטראקציה עם מקרו דיפול סליל. בגלל האופי בלתי נדיף ותרמית יציב של פפטידים, השיטה הקינטית היא הגישה המעשית ביותר שקיים כיום כדי לייצר כמויות thermochemical מדויקות למדי חומצת בסיס של פפטידים 28. התכנית הכללית והמשוואה קשורה לשיטה הקינטית מוצגות באיור 1. קביעת חומציות גז השלב של הפפטיד (AH) מתחילה עם הקמתה של סדרה של אניוני מצרר פרוטון בכריכות, [• H • i] ¯ (או [¯ • + H • אני ¯] ¯), באזור מקור יון של ספקטרומטר המסה, שבו ¯ ואני ¯ הם צורות deprotonated של הפפטיד וחומצות התייחסות, בהתאמה. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות עם acidities גז שלב ידוע. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה (אך לא בהכרח דומה לזה של פפטיד). הדמיון של המבנים בין חומצות התייחסות מבטיח דמיון של entropies של deprotonation ביניהם. אשכול פרוטון בכריכה האניונים נבחרו המוניים והופעל collisionally ולאחר מכן ניתק באמצעות התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים כדי להניב את אניוני monomeric המקביל, ¯ ואני ¯, עם קבועי קצב של K ו-K אני, בהתאמה, מוצג באיור 1 א. אם פיצולים משניים הם זניחים, יחס השפע של יוני בר CID, [¯] / [i ¯], מייצג מידה משוערת של היחס של קבועי קצב, K / K i. בהנחה שאין activat ההפוךמחסומי יונים בשני ערוצי דיסוציאציה, יון מוצר CID הסתעפות יחסים, בפיו [א ¯] / [A i ¯] חומצות התייחסות, יהיה מתואם ליניארי לחומציות גז השלב של הפפטיד (Δ החומצה H) ואלה של (Δ חומצת ח ט), כפי שמוצג באיור 1. במשוואה זו, Δ חומצת H ממוצע היא חומציות גז השלב הממוצעת של חומצות התייחסות, Δ (Δ S) הוא מונח האנטרופיה (שניתן להניח מתמיד אם חומצות התייחסות הן מבחינה מבנית דומות זה לזה), R הוא קבוע גז אוניברסלי, ו-T EFF הוא הטמפרטורה היעילה של המערכת. הטמפרטורה היעילה היא פרמטר אמפירי שתלוי במספר משתנים ניסיוניים, כולל את האנרגיה ההתנגשות. הערך של חומציות גז השלב נקבע על ידי בניית שני סטים של חלקות תרמו הקינטית. הסט הראשון הוא obמזרקה על ידי התוויית LN ([¯] / [i ¯]) נגד Δ חומצת H i - Δ חומצת H ממוצע, כפי שמוצגת באיור 4 א. רגרסיה לינארית תניב קבוצה של קווים ישרים עם המדרונות של X = 1 / RT EFF ומיירט של Y = - [Δ H החומצה - חומצת Δ H AVG] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. הסט השני של חלקות מתקבל על ידי מתכנן את תוצאת מיירט (Y) מהקבוצה הראשונה נגד המדרונות המתאימים (X), כפי שמוצגת באיור 4. רגרסיה לינארית מייצרת קו חדש עם שיפוע של Δ H החומצה - חומצת Δ H AVG ויירוט של Δ (Δ S) / R. הערך של Δ החומצה H לאחר מכן התקבל מהמדרון ומונח אנטרופיה, Δ (Δ S), מתקבלהיירוט. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש ממשק ליינון electrospray (ESI) מקור יון. תרשים סכמטי של ספקטרומטר המסה מוצג באיור 2. ניסויי CID מבוצעים על ידי מסת בחירת אניוני מצרר פרוטונים הכרוכים עם יחידת quadrupole הראשונה ומאפשרת להם לעבור התנגשויות עם אטומי ארגון דלפו לתוך תא ההתנגשות המתקיים בלחץ של סביב 0.5 mTorr. את יוני מוצר דיסוציאציה מנותחים המוניים עם יחידת quadrupole השלישית. ספקטרום CID נרשם בכמה אנרגיות התנגשות עם מגוון מ &#39;/ z הרחב מספיק כדי לכסות את כל שברים משניים האפשריים. עוצמות יון מוצר CID נמדדות על ידי הגדרת המכשיר בניטור התגובה הנבחרת (SRM) במצב שבו הסריקה מתמקדת ביוני מוצר נבחרים. ניסויי CID מבוצעים בארבע אנרגיות התנגשות שונות, המקביל לאנרגיות מרכז מסה של-E (ס&quot;מ) של 1.0, 1.5, 2.0, ו -2.5 EV, בהתאמה. מרכז האנרגיה של המסה מחושבת באמצעות המשוואה: E = E ס&quot;מ המעבדה [מ &#39;/ (M + מ&#39;)], שבו דואר מעבדה היא האנרגיה ההתנגשות במסגרת המעבדה, מ &#39;הוא המסה של ארגון, ו-M הוא המסה של פרוטון יון האשכול בכריכה. במאמר זה, אנו משתמשים עלא Oligopeptide 3 CysNH 2 (CH 3) כמתחם המודל. C-הסופית הוא amidated וקבוצת תיאול (SH) של שאריות ציסטאין תהיה חומצי באתר. הבחירה של חומצות התייחסות המתאימות היא קריטית למדידת ההצלחה של חומציות גז השלב. חומצות התייחסות האידיאליות הן דומות מבחינה מבנית (זה לזה) תרכובות אורגניות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות ערכי חומציות קרובים לזו של פפטידים. לפפטיד CH 3, שש הלוגניים carboxyliחומצות C הן נבחרו כחומצות התייחסות. חומצות התייחסות לשש הן חומצת chloroacetic (MCAH), bromoacetic חומצה (MBAH), חומצת difluoroacetic (DFAH), חומצת dichloroacetic (DCAH), חומצת dibromoacetic (DBAH), וtrifluoroacetic (TFAH). שניים מהם, וDFAH MBAH, ישמש כדי להמחיש את הפרוטוקול.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

שאריות חומצת אמינו הנמצאים בתפקידים שונים בחלבונים מקופלים מפגינות לעתים קרובות דרגות acidities שונות. לדוגמה, שאריות ציסטאין ממוקמים ליד או N-סופית של סליל היא לעתים קרובות יותר חומצי מזה ליד או C-הסופית 1-6. למרות שמחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים בוצעו בשלב המרוכז, במיוחד בתמיסות מימיות 6-8, התוצאות לעתים קרובות מסובכות על ידי השפעות ממס 7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס כבר ממוזערים 9,10. על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע המחקרים בסביבה נטולת ממס. אנו מציגים שיטה למדידת acidities של oligopeptides בגז השלב. אנו משתמשים המכיל ציסטאין Oligopeptide, עלא 3 CysNH <sUB&gt; 2 (CH 3), כמודל למתחם. המדידות מתבססות על השיטה המבוססת היטב המורחבת טבחים הקינטית (איור 1) 11-16. הניסויים מתבצעים באמצעות ספקטרומטר מסה משולש quadrupole ממשק עם יינון electrospray (ESI) מקור יון (איור 2). עבור כל דגימת פפטיד, חומצות התייחסות למספר נבחרו. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם acidities גז שלב ידוע. פתרון של התערובת של הפפטיד וחומצת התייחסות מוחדר ספקטרומטר המסה, ומקבץ anionic גז שלב פרוטון בכריכה של חומצת פפטיד הפניה הוא נוצר. אשכול פרוטון בכריכה מבודד המוני ומקוטע בהמשך דרך התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים. את שכיחות יון שבר כתוצאה מכך הם נותחו באמצעות מערכת יחסים בין acidities וקינטיקה דיסוציאציה יון האשכול. חומציות גז השלב של הפפטיד היא אז obtaiנד על ידי רגרסיה לינארית של החלקות תרמו הקינטית 17,18. השיטה ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מולקולריות, כולל תרכובות אורגניות, חומצות אמינו ונגזרותיהם, oligonucleotides וoligopeptides. על ידי השוואת acidities גז השלב נמדד בניסוי עם אותם הערכים שחושבו עבור conformers שונה, ניתן להעריך השפעות קונפורמציה על acidities.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויי סוגר CID לספק מידע על acidities היחסי של פפטיד בהשוואה לחומצות התייחסות לנבחרות. שניים ספקטרום CID נציג של הפפטיד (CH 3) עם שתי חומצות התייחסות, וDFAH MBAH, מוצג באיור 3. באיור 3 א שפע יון (גובה שיא) של יון פפטיד הוא חלש יותר מזה של DFA ¯, ובאיור 3</str...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

קביעת acidities גז השלב של oligopeptides המכיל ציסטאין מתוארת. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש. את acidities היחסי של פפטידים נמדדים באמצעות ניסויי דיסוציאציה התנגשות-Induced, ואת acidities כמותיות נקבעות באמצעות טבחים ממושכים שיטה קינטית.

קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

קביעה המהירה amylose התפוקה גבוה בדוגמאות פקעת תפוח האדמה להקפיא יבשים

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

היווצרות של מבני Biomolecular הוזמנו על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים קצרים

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

קביעת קבוצות פונקציונליות קרבוניל Bio-שמנים ידי טיטרציה פוטנציומטריים: שיטת Faix

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

קביעת מאפייני תרמודינמי בסגסוגות מתכת עפרורית נוזלי בטכניקה כוח אלקטרו מניע

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Disentangling חוזק גבוה קופולימר ארמיד סיבים כדי לאפשר קביעת תכונות מכניות שלהם

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

סינתזה וקביעת מבנה ממוצע-Conotoxin Isomers PIIIA עם Connectivities דיסולפידי שונים

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides