Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
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<p class="jove_content"&gt; Il lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (CHE-0.749.737). L&#39;utilizzo dello strumento è stata fornita dalla spettrometria di massa Struttura presso la University of the Pacific.</p

1. Preparazione delle soluzioni campione <ol><li> Prima preparare le soluzioni madre del peptide e gli acidi riferimento sei usando un solvente misto di metanolo e acqua in un rapporto in volume di 1:1. Le soluzioni madre dovrebbero avere una concentrazione di circa 10 -3 M. </li><li> Pesare 1 mg del campione peptide solido, A 3 CH, in una provetta Eppendorf 1,5 ml e aggiungere 1,0 ml di solvente misto di metanolo e acqua, e miscelare con un vortice. </li><li> Pesare 1 mg di acido difluoroacetic ...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. 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La misurazione di successo della acidità in fase gassosa di un peptide basa in gran parte sulla selezione di acidi riferimento adeguati. Gli acidi riferimento ideali sono composti organici strutturalmente simili con valori di acidità in fase gas ben consolidati. Gli acidi riferimento dovrebbero avere strutture simili tra loro. Ciò garantirà un simile entropia di deprotonazione per ciascuno degli acidi riferimento del set. Gli acidi di riferimento devono avere valori di acidità prossimi a quelli dei peptidi. Per bre...

Le acidità di residui di aminoacidi sono tra i più importanti proprietà termochimici che influenzano le strutture, la reattività, e dei processi di piegatura-unfolding di proteine ​​9,19. Residui di singoli aminoacidi mostrano spesso diverse acidità efficaci a seconda delle loro posizioni in proteine. In particolare, i residui presenti in altri siti attivi presentano spesso perturbato significativamente acidità. Un esempio è il residuo di cisteina che risiedono nei siti attivi della tioredossina super-famiglia di enzimi 20,21. Il sito attivo è insolitamente cisteina acido rispetto a quelle in dispiegato proteine ​​3-5. È stato suggerito che la conformazione elicoidale può avere un contributo significativo alla acidità insolito. Ci sono ampi studi sperimentali sulle proprietà acido-base di peptidi effettuati in soluzioni, specialmente in soluzioni acquose 2,6-8. I risultati sono stati spesso complicati da effetti solvente7. Infatti, la maggior parte dei siti attivi di proteine ​​si trovano vicino alla regione interna dove effetti del solvente sono minimizzati 9,10. Per comprendere intrinseche proprietà acido-base di peptidi e proteine, è importante realizzare gli studi in un ambiente privo di solventi. Qui si introduce un metodo di spettrometria di massa a base per la determinazione dell&#39;acidità in fase gas. L&#39;approccio è indicato come il metodo cinetico Cuochi esteso. Questo metodo è stato applicato con successo per una vasta gamma di sistemi chimici per la determinazione delle varie proprietà termochimici, come l&#39;acidità in fase gassosa, l&#39;affinità protonica, lo ione metallico affinità, l&#39;affinità elettronica, e l&#39;energia di ionizzazione 11-15, 22-26. Abbiamo applicato questo metodo per determinare le acidità in fase gas di una serie di oligo-cisteina-cisteina e polialanine polyglycine peptidi 17,18,27. Questi studi dimostrano che la cisteina N-terminale peptidees sono significativamente più acido di quello dei corrispondenti quelli C-terminale. Le alte acidità delle prime sono probabilmente dovuti agli effetti conformazionali elicoidali in cui l&#39;anione tiolato è fortemente stabilizzato dalla interazione con l&#39;elica macro-dipolo. A causa della natura non volatile e termicamente labile di peptidi, il metodo cinetico è l&#39;approccio più pratico attualmente disponibili per produrre ragionevolmente accurate acido-base termochimici quantità di peptidi 28. Nel regime generale e l&#39;equazione associato al metodo cinetico sono mostrati in Figura 1. La determinazione dell&#39;acidità in fase gassosa di un peptide (AH) inizia con la formazione di una serie di cluster di anioni protone-bound, [A • H • A i] ¯ (o [A + H ¯ • • A i ¯] ¯), nella regione di sorgente ionica dello spettrometro di massa, dove A e A i ¯ ¯ sono le forme deprotonate del peptide egli acidi di riferimento, rispettivamente. Gli acidi di riferimento sono composti organici con noti acidità in fase gas. Gli acidi riferimento dovrebbero avere strutture analoghe tra loro (ma non necessariamente simile a quella del peptide). La somiglianza delle strutture tra acidi riferimento assicura la somiglianza dei entropie di deprotonazione tra loro. Il cluster protone-bound anioni vengono selezionati e massa collisionally attivati ​​e successivamente dissociato usando dissociazione (CID) esperimenti di collisione indotti a cedere gli anioni corrispondenti monomeriche, A e A i ¯ ¯, con rate costanti di K e K i, rispettivamente, mostrata in Figura 1a. Se frammentazioni secondarie sono trascurabili, il rapporto di abbondanza dei frammenti ionici CID, [A ¯] / [A i ¯], rappresenta una misura approssimativa del rapporto tra le costanti di velocità, k / k i. Partendo dal presupposto che non ci sono attivata inverso, [A °] / [A I °], verrà linearmente correlati all&#39;acidità fase gas del peptide (Δ acido H) e quelli degli acidi riferimento ln barriere per entrambi i canali ionici dissociazione, il CID ione prodotto branching ratio (acido Δ H i), come mostrato in Figura 1b. In questa equazione, acido Δ H avg è la media acidità in fase gassosa degli acidi riferimento, Δ (Δ S) è il termine entropia (che può essere assunta costante se gli acidi riferimento sono strutturalmente simili tra loro), R è la costante universale dei gas, e T eff è la temperatura effettiva del sistema. La temperatura efficace è un parametro empirico che dipende da diverse variabili sperimentali, inclusi l&#39;energia di collisione. Il valore di acidità in fase gassosa è determinato disegnando due serie di trame termo-cinetici. La prima serie è obcontenute tracciando ln ([A ¯] / [A i ¯]) contro l&#39;acido Δ H i - acido Δ H avg, come mostrato nella figura 4a. La regressione lineare produrrà una serie di linee rette con le piste di X = 1 / RT eff e intercetta di Y = - [Δ H acido - acido Δ H avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R. La seconda serie di trame viene ottenuta riportando le intercettazioni risultanti (Y) con la prima serie contro le corrispondenti piste (X), come mostrato in Figura 4b. La regressione lineare produce una nuova linea con una pendenza di Δ H acido - acido Δ H avg e un&#39;intercettazione di Δ (Δ S) / R. Il valore di Δ acido H si ottiene poi dal pendio e il termine entropia, Δ (Δ S), è ottenuto dal&#39;intercetta. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo interfacciato ad un ionizzazione elettrospray (ESI) sorgente di ioni. Un diagramma schematico dello spettrometro di massa è mostrato in Figura 2. Gli esperimenti vengono eseguiti CID in massa selezionando gli anioni del cluster protone-bound con la prima unità quadrupolo e permettendo loro di sottoporsi collisioni con atomi di argon fuoriusciti nella camera di collisione mantenuto ad una pressione di circa 0,5 mTorr. Gli ioni prodotti di dissociazione di massa sono analizzati con la terza unità quadrupolo. Gli spettri CID sono registrati in diverse energie di collisione con il range m / z sufficientemente ampia da coprire tutte le possibili frammenti secondari. I CID intensità di ioni prodotti vengono misurate impostando lo strumento nel monitoraggio reazione selezionato (SRM) modalità in cui la scansione è focalizzata sulla ioni prodotti selezionati. Gli esperimenti CID vengono eseguite in quattro diverse energie di collisione, che corrispondono aenergie centro-di-massa (E cm) di 1.0, 1.5, 2.0, e 2.5 eV, rispettivamente. L&#39;energia centro-di-massa è calcolata usando l&#39;equazione: E = E cm lab [m / (M + m)], dove E è l&#39;energia laboratorio collisione nel sistema del laboratorio, m è la massa di argon, e M è la massa dello ione cluster di protone-bound. In questo articolo, si usa il oligopeptide Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) come composto modello. Il C-terminale è amidate e il gruppo tiolo (SH) del residuo cisteina sarà il sito acida. La selezione degli acidi riferimento adeguati è fondamentale per la misurazione riuscita dell&#39;acidità fase gas. Gli acidi riferimento ideali sono strutturalmente simili (tra loro) composti organici con valori di acidità in fase gas ben consolidati. Gli acidi di riferimento devono avere valori di acidità prossime a quella dei peptidi. Per il peptide A 3 CH, sei alogenati carboxyliacidi c sono scelti come gli acidi di riferimento. Gli acidi di riferimento sei sono cloroacetico (MCAH), acido bromoacetico (Mbah), acido difluoroacetic (DFAH), acido dicloroacetico (DCAH), acido dibromoacetic (dban), e trifluoroacetico (TFAH). Due di loro, DFAH e Mbah, saranno utilizzati per illustrare il protocollo.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Residui amminoacidici situati in posizioni differenti in proteine ​​ripiegate spesso mostrano diversi gradi di acidità. Per esempio, un residuo di cisteina situato in prossimità o al N-terminale di un elica è spesso più acido che in prossimità o al C-terminale 1-6. Sebbene ampi studi sperimentali sulle proprietà acido-base di peptidi sono stati effettuati nella fase condensata, in particolare in soluzioni acquose 6-8, i risultati sono spesso complicati da effetti solvente 7. Infatti, la maggior parte dei siti attivi di proteine ​​si trovano vicino alla regione interna in cui sono stati minimizzati effetti del solvente 9,10. Per comprendere intrinseche proprietà acido-base di peptidi e proteine, è importante effettuare gli studi in un ambiente privo di solventi. Presentiamo un metodo per misurare le acidità degli oligopeptidi in fase gas. Usiamo una cisteina contenente oligopeptide, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (A 3 CH), come composto modello. Le misurazioni sono basate sul metodo cinetico esteso Cuochi consolidata (Figura 1) 11-16. Gli esperimenti vengono eseguiti usando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo interfacciato con ionizzazione elettrospray (ESI) sorgente di ioni (Figura 2). Per ogni campione peptide, sono selezionati diversi acidi riferimento. Gli acidi di riferimento sono composti organici strutturalmente simili con noti acidità in fase gas. Una soluzione della miscela del peptide e un acido riferimento viene introdotta nello spettrometro di massa, ed una fase gassosa protone-bound gruppo anionico di acido-peptide di riferimento è formato. Il cluster protone-bound è massa isolata e successivamente frammentata tramite dissociazione (CID) esperimenti di collisione-indotte. I risultanti abbondanze di ioni frammento vengono analizzati utilizzando un rapporto tra le acidità e il cluster di ioni dissociazione cinetica. L&#39;acidità fase gas del peptide è poi ottenito da regressione lineare delle trame termo-cinetica 17,18. Il metodo può essere applicato ad una varietà di sistemi molecolari, compresi i composti organici, amminoacidi e loro derivati, oligonucleotidi e degli oligopeptidi. Confrontando le acidità fase gas misurati sperimentalmente con quei valori calcolati per i diversi conformeri, effetti conformazionali sui acidità possono essere valutati.

<ol><li> Gli esperimenti bracketing CID forniscono informazioni sui relativi acidità del peptide rispetto agli acidi riferimento selezionati. Due rappresentativo spettri CID del peptide (A 3 CH) con due acidi riferimento, DFAH e Mbah, sono mostrati in Figura 3. In Figura 3a all&#39;abbondanza ione (altezza picco) del peptide ione è più debole di quella del DFA ¯, e in Figura 3b, l&#39;abbondanza ione dello ione peptide è più forte di quello del MBA ¯. I due spettri suggeriscon...

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

La determinazione delle acidità fase gas di oligopeptidi contenenti cisteina è descritto. Gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Le acidità relative dei peptidi sono valutate con esperimenti di dissociazione indotta da collisione, e le acidità quantitativi sono determinati utilizzando i Cuochi estesi metodo cinetico.

Determinazione delle acidità in fase gassosa di oligopeptidi

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid High Throughput amilosio Determinazione in liofilizzati campioni dei tuberi

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

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Chimica

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Determinazione del carbonile gruppi funzionali in Bio-oli da potenziometrica Titolazione: Il Metodo Faix

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

Determinazione delle proprietà termodinamiche di leghe di metalli alcalino-terrosi-liquido usando la tecnica di forza elettromotrice

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Districante fibre di aramide copolimero ad alta resistenza per consentire la determinazione delle loro proprietà meccaniche

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Tecniche di spettrometria ione Mobilità-Massa per determinare la struttura e i meccanismi del riconoscimento degli ioni metallici e dell'attività di redox degli oligopeptidi di metal linciazione