Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Arbeidet ble støttet av National Science Foundation (CHE-0749737). Instrumentet bruk ble gitt av massespektrometri Facility ved University of the Pacific.</p

En. Tilberedning av prøven Solutions <ol><li> Tilberedes først stamløsninger av peptid og de seks referanse RNA ved bruk av en blandet oppløsningsmiddel av metanol og vann i et volumforhold 01:01. De stamløsninger bør ha en konsentrasjon på omtrent 10 -3 M. </li><li> Vei opp 1 mg av den faste prøven peptid, A 3 CH, i et 1,5 ml Eppendorf-rør og tilsett 1,0 ml av blandet oppløsningsmiddel av metanol og vann, og blandes ved hjelp av en vortex. </li><li> Vei opp 1 mg Difluoreddiksyre (DFAH)...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

Den vellykkede måling av gassfase-surhet av et peptid avhengig i stor grad av valget av egnede syrer referanse. Den ideelle referanse syrer er strukturelt ligner organiske forbindelser med veletablerte gass-fase surhet verdier. Referansepunktene syrer bør ha lignende strukturer til hverandre. Dette vil sikre en lignende entropi av deprotonering for hvert av referanse syrer i settet. Referansepunktene syrer bør ha surhet verdier nær dem av peptidene. For kortere cystein-inneholdende oligopeptider med amidert C-termin...

De acidities av aminosyrer er blant de viktigste termokjemiske egenskaper som påvirker strukturene, den reaktivitet, og folding-utfolder prosesser av proteiner 9,19. Individuelle aminosyrer ofte viser ulike effektive acidities avhengig av deres steder i proteiner. Spesielt rester ligger i de aktive setene viser ofte betydelig perturberte acidities. Ett slikt eksempel er cysteinrest bosatt i de aktive områder av thioredoxin super-familien av enzymer 20,21. Den aktive sete cystein er unormalt surt forhold til de i utfoldet proteiner 3-5. Det har vært antydet at det skruelinjeformede konformasjon kan ha et betydelig bidrag til den uvanlige surhet. Det er omfattende eksperimentelle studier på syre-base-egenskaper av peptider gjennomføres i oppløsninger, spesielt i vandige oppløsninger 2,6-8. Resultatene ble ofte komplisert av løsemiddel effekter7. Faktisk er mesteparten av de aktive seter i proteiner lokalisert nær den indre område hvor løsemiddel effekter minimaliseres 9,10. For å forstå iboende syre-base-egenskaper av peptider og proteiner, er det viktig å utføre studiene i et oppløsningsmiddel-fritt miljø. Her introduserer vi en massespektrometri-basert metode for bestemmelse av gass-fase surhet. Denne tilnærmingen er omtalt som den utvidede Cooks kinetisk metode. Denne metoden har blitt vellykket anvendt for et bredt utvalg av kjemiske systemer for bestemmelse av forskjellige termokjemiske egenskaper, så som gassfase-surhet, proton affinitet, metallionet affinitet, elektronet affinitet, og ioniseringsenergien 11-15, 22-26. Vi har brukt denne metoden for å bestemme gass-fase acidities av en serie med oligo cystein-polyalanine og cystein-polyglycine peptider 17,18,27. Disse studiene viser at N-terminal cystein peptides er betydelig surere enn de tilsvarende C-terminale seg. De høye acidities av det tidligere er trolig på grunn av de spiralformede konformasjonsforandringer effekter der tiolatanion er sterkt stabilisert av samspillet med helix makro-dipol. På grunn av den ikke-flyktige og termisk labile naturen av peptider, er den kinetiske metode den mest praktiske tilnærmingen finnes idag for å produsere rimelig nøyaktig syre-base termokjemiske mengder av peptidene 28. Den generelle ordningen og ligningen forbundet med den kinetiske metode er vist på figur 1. Fastsettelsen av gass-fase surhet av et peptid (AH) starter med dannelsen av en serie av proton-bundet cluster anioner, [A • H • En i] ¯ (eller [A ¯ • H + • Å i ¯] ¯), i ionekilden region av massespektrometer, hvor A og A i ¯ ¯ er deprotonert former av peptidet ogreferanse syrer, henholdsvis. De referanse syrer er organiske forbindelser med kjente gass-fase acidities. Referansepunktene syrer bør ha strukturer som ligner hverandre (men ikke nødvendigvis lik den for peptid). Likheten av strukturene mellom referanse syrer sikrer likheten av entropies av deprotonering blant dem. Proton-bundet klynge anioner er valgt masse og collisionally aktivert og deretter dissosiert med sammenstøt-indusert dissosiasjon (CID) eksperimenter for å gi det tilsvarende monomere anioner, A og A i ¯ ¯, med hastighetskonstanter av K og k i, henholdsvis, er vist i figur 1a. Dersom sekundære fragmentations er ubetydelige, overflod forholdet av CID-fragment-ioner, [A ¯] / [Å i ¯], representerer et tilnærmet mål for forholdet mellom hastighetskonstantene, k / k i. Under forutsetning av at det ikke er omvendt aktiion barrierer for både dissosiasjon kanaler, CID produkt ion forgreningsforhold, Ln [A •] / [Å i ¯], vil bli lineært korrelert til gassfase-surhet av peptidet (Δ syre H) og de ​​av referanse-syrer (Δ syre H-i), som vist i figur 1b. I denne ligningen er Δ syre H avg gjennomsnittlig gass-fase surhet av referanse syrer, er Δ (Δ S) entropi sikt (som kan antas konstant dersom referanse syrer er strukturelt lik hverandre), er R universelle gasskonstanten og T eff er den effektive temperaturen i systemet. Den effektive temperatur er en empirisk parameter som avhenger av flere eksperimentelle variabler, inkludert kollisjonsenergien. Verdien av gassfaseprosessen surhet bestemmes ved å konstruere to sett av termo-kinetiske plott. Det første settet er obskje ved å plotte ln ([A ¯] / [A i ¯]) mot Δ syre H i - Δ syre H gj.snitt, som vist i figur 4a. Lineær regresjon vil gi et sett med rette linjer med bakkene i X = 1 / RT eff og fanger av Y = - [Δ syre H - Δ syre H avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R. Det andre settet av tomter blir oppnådd ved å plotte de resulterende avskjærer (y) fra det første sett mot de tilsvarende bakker (X), som vist i figur 4b. Lineær regresjon produserer en ny linje med en helling på Δ syre H - Δ syre H avg og en fange av Δ (Δ S) / R. Verdien av Δ syre H blir deretter oppnådd fra helling og entropi sikt, Δ (Δ S), innhentesskjæringspunktet. Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel kvadrupol massespektrometer sammenknyttet med en elektrospray ionisering (ESI) ionekilde. Et skjematisk diagram av massespektrometer er vist i figur 2.. De CID eksperimenter utføres etter masse å velge de proton-bundet cluster anioner med den første kvadrupol enhet og gi dem muligheten til å gjennomgå kollisjoner med argon atomer lekket inn i kollisjonen kammer som er holdt ved et trykk på rundt 0,5 mTorr. De dissosiasjon produktet ioner er masse analysert med den tredje kvadrupol enhet. CID spektra er registrert på flere kollisjon energier med m / z serien bred nok til å dekke alle mulige sekundære fragmenter. De CID produkt ion intensiteter måles ved å sette instrumentet i den valgte reaksjon overvåking (SRM) modus der skanningen er fokusert på utvalgte produktområdene ioner. De CID eksperimenter utføres på fire forskjellige kollisjon energier, tilsvarendecenter-of-masse energi (E cm) på 1,0, 1,5, 2,0, og 2,5 eV, henholdsvis. Senter-til-masse energien beregnes ved hjelp av ligningen: E = E cm lab [M / (M + m)], hvor E er lab kollisjonsenergien i laboratoriet ramme, m er massen av argon, og M er massen av den proton-bundet klynge ion. I denne artikkelen bruker vi oligopeptide Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som modell sammensatte. C-terminalen er amidert, og tiolgruppe (SH) av cystein-rester vil være det sure område. Valget av egnet referanse syrer er avgjørende for en vellykket måling av gassfase-surhet. Den ideelle referanse syrer er strukturelt lik (til hverandre) organiske forbindelser med veletablerte gass-fase surhet verdier. Referansepunktene syrer bør ha surhet verdier nær at av peptider. For peptid A 3 CH, halogenerte seks carboxylic syrer er valgt som referanse-syrer. De seks referanse syrer er kloreddiksyre (MCAH), bromeddiksyre (mbah), Difluoreddiksyre (DFAH), dikloreddiksyreanhydrid syre (DCAH), dibromoacetic syre (DBAH), og trifluoreddiksyre (TFAH). To av dem, vil DFAH og mbah, benyttes til å illustrere den protokoll.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Aminosyre rester ligger på forskjellige posisjoner i foldede proteiner ofte viser ulike grader av acidities. For eksempel er en cysteinrest lokalisert ved eller nær N-enden av en heliks ofte mer surt enn det på eller nær C-terminus 1-6. Selv om omfattende eksperimentelle studier på syre-base-egenskaper av peptidene er blitt gjennomført i den kondenserte fase, spesielt i vandige oppløsninger 6-8 er resultatene ofte komplisert av løsemiddel effekter 7. Faktisk er mesteparten av de aktive seter i proteiner lokalisert nær den indre område hvor løsemiddel effekter har blitt minimalisert 9,10. For å forstå iboende syre-base-egenskaper av peptider og proteiner, er det viktig å utføre studiene i et oppløsningsmiddel-fritt miljø. Vi presenterer en metode for å måle acidities av oligopeptider i gass-fase. Vi bruker en cystein-holdig oligopeptide, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (A 3 CH), slik modellen forbindelsen. Målingene er basert på de veletablerte utvidet Cooks kinetisk metode (figur 1) 11-16. Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel-kvadrupol massespektrometer tilkobles med en electrospray ionisering (ESI) ion kilde (figur 2). For hvert peptid prøve, blir flere referansepunkter syrer valgt. De referanse syrer er strukturelt ligner organiske forbindelser med kjente gass-fase acidities. En oppløsning av blandingen av peptidet og et referanse-syre innføres i massespektrometeret, og en gass-fase proton-bundet anionisk klynge av peptid-referanse syre dannes. Proton-bundet klyngen er masse isolert og deretter fragmentert via kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) eksperimenter. De resulterende fragment ion abundances er analysert ved hjelp av et forhold mellom acidities og klyngen ion dissosiasjon kinetikk. Den gass-fase surhet av peptidet er da obtainert ved lineær regresjon av termo-kinetiske tomter 17,18. Fremgangsmåten kan anvendes på en rekke ulike molekylære systemer, inklusive organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, oligonukleotider og oligopeptider. Ved å sammenligne de gass-fase acidities målt eksperimentelt med de verdiene som er beregnet for forskjellige conformers kan konformasjonsendringer virkninger på acidities evalueres.

<ol><li> De CID bracketing eksperimenter gi informasjon om de relative acidities av peptid i forhold til de valgte referanse syrer. To representative CID-spektra av peptidet (A CH 3) med to referanse-syrer, DFAH og mbah, er vist i figur 3.. I figur 3a ione overflod (topphøyde) av peptidet ion er svakere enn den av DFA ¯, og i figur 3b er det ion overflod av peptidet ion sterkere enn MBA ¯. De to spektra antyder at gassfase-surheten av peptid er i størrelsesorden mellom acidities ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Bestemmelsen av gassfase-acidities av cystein-inneholdende oligopeptider er beskrevet. Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel kvadrupol massespektrometer. De relative acidities av peptidene blir målt ved hjelp av kollisjon-indusert dissosiasjon eksperimenter, og de kvantitative acidities fastlegges ved hjelp av utvidede Cooks kinetisk metode.

Bestemmelse av gass-fase Acidities av Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid høy gjennomstrømning Amylose Bestemmelse i Freeze Tørket potet Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse av Bestilte biomolekylære strukturer ved selvbygging av Short Peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

Fra konstruerer Crystals - Mot Struktur Bestemmelse av β-fat ytre membranproteiner

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Fastsettelse av Karbonyl funksjonelle grupper i bio-oljer av Potensiometrisk titrering: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

Fastsettelse av termodynamisk egenskaper av alkalisk jord-flytende metall legeringer med Elektromotorisk kraft-teknikk

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Disentangling høy styrke Copolymer Aramid fibre å aktivere fastsettelse av sine mekaniske egenskaper

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Syntese og proteinstrukturer av μ-Conotoxin PIIIA isomerene med forskjellige Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ion Mobility-Mass massespektrometri teknikker for fastsettelse av struktur og mekanismer for metal ion Recognition og Redox aktivitet av metall bindende Oligopeptides