Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда (CHE-0749737). Использования инструмента были предоставлены фондом масс-спектрометрии в университете Тихого океана.</p

1. Подготовка образца Решения <ol><li> Первый подготовить исходные растворы пептидов и шесть кислоты ссылкой использованием смешанного растворител из метанола и воды в соотношении 1:1 по объему. Маточные растворы должны иметь концентрацию примерно 10 -3 М </li><li> Взвесить 1 мг твердого о...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

Успешное измерение в газовой фазе кислотность пептида, в значительной степени зависит от выбора подходящих кислот ссылки. Идеальный кислот ссылкой структурно сходные органические соединения с хорошо известными в газовой фазе значений кислотности. Опорный кислоты должны иметь сходн?...

Кислотности аминокислотные остатки являются одними из наиболее важных термохимических свойств, которые влияют на структуры, реакционной способности, а также складной-разворачивания процессов белков 9,19. Индивидуальные аминокислотные остатки часто показывают различные эффективные кислотности в зависимости от их расположения в белках. В частности, в остатках, расположенных в активных центрах часто демонстрируют значительно возмущенного кислотности. Одним из таких примеров является остаток цистеина, проживающих в активных центрах тиоредоксин супер-семейство ферментов 20,21. Активное цистеина сайта необычно кислой сравнению с теми в развернутых белков 3-5. Было высказано предположение о том, что спиральной конформации может иметь значительный вклад в необычном кислотности. Есть обширные экспериментальные исследования на кислотно-основные свойства пептидов проводили в растворе, особенно в водных растворах 2,6-8. Результаты были часто осложняется эффекты растворителя7. В действительности, большинство активных центров в белках находятся вблизи внутренней области, где растворитель эффекты минимизированы 9,10. Для того, чтобы понять внутреннюю кислотно-основные свойства пептидов и белков, важно проводить исследования растворителей среды. Здесь мы вводим масс-спектрометрии метод, основанный на определении газовой фазе кислотность. Этот подход упоминается как расширенная повара кинетического метода. Этот метод был успешно применен к широкому спектру химических систем для определения различных термохимических свойств, таких как в газовой фазе кислотность, сродство протон, сродство ионов металлов, сродство к электрону и энергии ионизации 11-15 22-26. Мы применили этот метод для определения газовой фазы кислотности серии олиго-цистеин-полиаланином и цистеин-полиглицине пептидов 17,18,27. Эти исследования показывают, что N-концевой цистеин Peptidы значительно более кислой, чем соответствующий С-концевой них. Высокая кислотность бывшего, вероятно, вследствие спиральной конформационных эффектов, в которых анион тиолята сильно стабилизированные взаимодействие с спирали макро-диполь. Из-за энергонезависимой и термонеустойчивое природе пептидов, кинетический метод является наиболее практичным подходом доступных в настоящее время для получения достаточно точных кислотно-щелочного термохимической количеств пептидов 28. Общая схема и уравнение связанных с кинетического метода показаны на рисунке 1. Определение газовой фазе кислотность пептид (AH) начинается с образованием ряда протон связанного кластерных анионов [A • H • г] ¯ (или [¯ • H + • я ¯] ¯) в ионном области источника в масс-спектрометр, где ¯ и я ¯ являются депротонированную формы пептида иопорный кислоты соответственно. Опорный кислот органических соединений с известной газовой фазе кислотности. Опорный кислоты должны иметь структуры похожи друг на друга (но не обязательно же, как пептид). Сходство между опорными структурами кислот обеспечивает сходство энтропии депротонирование среди них. Протон-связанного кластера анионы массы выбраны и активированы и столкновительно впоследствии диссоциированными использованием индуцированных столкновениями диссоциации (CID) эксперименты с получением соответствующего мономерных анионов, и ¯ ¯ я, с константами скорости К и К я, соответственно, как показано на рисунке 1а. Если вторичный фрагментации являются незначительными, относительное содержание CID фрагментарных ионов, [¯] / [я ¯], представляет собой приблизительную оценку отношение констант скорости, к / к я. В предположении, что нет обратной активированнойионных барьеров для диссоциации каналов CID ион продукт ветвления, Л. Н. [¯] / [я ¯], будет линейно коррелирует с газовой фазе кислотность пептид (Δ кислота H), и те из кислот ссылки (Δ кислоты H I), как показано на рисунке 1b. В этом уравнении Δ кислота H ср является средним газовой фазе кислотность ссылкой кислоты, Δ (Δ S)-энтропия термин (который можно считать постоянным, если ссылка кислоты являются структурно похожи друг на друга), R представляет Универсальная газовая постоянная, Т эфф эффективной температуры системы. Эффективная температура эмпирический параметр, зависящий от нескольких экспериментальных переменных, в том числе энергии столкновения. Значение газовой фазе кислотность определяется путем построения двух наборов термо-кинетический участков. Первый набор наблюдаетсяполученные путем построения LN ([¯] / [Я ¯]) против Δ кислоты H I - Δ H Средняя кислоты, как показано на рисунке 4а. Линейная регрессия даст множество прямых с наклоном X = 1 / RT эфф и перехватывает у = - [Δ кислоты H - Δ кислоты H Средняя] / RT эфф - Δ (Δ S) / R. Второй набор участков получены путем построения в результате перехватывает (Y) из первого набора по сравнению с соответствующим склонов (X), как показано на фиг.4b. Линейная регрессия выпускает новую линию с наклоном кислоты H Δ - Δ H Средняя кислоты и перехват Δ (Δ S) / R. Значение Δ кислоты H Затем определяется по наклону и энтропийный член, Δ (Δ S), получается изперехват. Эксперименты проводили с использованием тройной квадрупольный масс-спектрометр сопряжена с ионизацией электрораспылением (ESI) источник ионов. Схема масс-спектрометра показан на рисунке 2. CID Эксперименты проводились по массе выбора протон-связанного кластера анионов с первым блоком квадрупольного и дают им возможность пройти столкновений с атомами аргона просочилась в камере столкновений, который проводится при давлении от около 0,5 мТорр. Ионы диссоциации продукта массой проанализированы с третьего блока квадрупольного. CID спектры записаны на нескольких энергиях столкновения с м / з диапазон достаточно широк, чтобы охватить все возможные вторичные фрагменты. CID интенсивности ионного продукта измеряется путем установки инструмента в выбранной мониторинга реакции (SRM) режим, в котором сканирование сосредоточено на выбранных ионов продукта. CID Эксперименты проводились на четырех различных энергиях столкновения, соответствующихЦентр масс энергиях (Е см) 1.0, 1.5, 2.0 и 2.5 эВ соответственно. Центр масс энергии рассчитывается по следующей формуле: E = E см лаборатории [/ (м + м)], где E лаборатории энергия столкновения в лабораторной системе, т-масса аргона и М Масса протона связанного кластер ион. В этой статье мы используем олигопептиду Ала 3 CysNH 2 (CH 3) в качестве модельного соединения. С-конец амидирован, а группа тиола (SH) остатка цистеина будет кислой сайта. Выбор подходящих кислот ссылка является важным для успешного измерений в газовой фазе кислотность. Идеальный кислоты ссылкой структурно подобны (друг на друга) органических соединений с хорошо известными в газовой фазе значений кислотности. Опорный кислоты должны иметь кислотность значений, близких к что пептидов. Для пептид 3 CH, шесть галогенированной карбоновойС кислот выбраны в качестве опорного кислот. Шесть кислот являются ссылкой хлоруксусную кислоты (MCAH), бромуксусную кислоты (Мбах), дифторуксусная кислоты (DFAH), дихлоруксусной кислоты (DCAH), dibromoacetic кислоты (DBAH) и трифторуксусной (TFAH). Двое из них, и DFAH Мбах, будет использоваться для иллюстрации работы протокола.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Аминокислотные остатки, расположенные в различных местах в свернутых белков часто демонстрируют различную степень кислотности. Например, остаток цистеина расположены на или вблизи N-конца спирали, часто более кислой, чем на или вблизи С-конца 1-6. Несмотря на обширные экспериментальные исследования на кислотно-основные свойства пептидов были проведены в конденсированной фазе, в частности, в водных растворах 6-8, результаты часто осложняются эффекты растворителя 7. В действительности, большинство активных центров в белках находятся вблизи внутренней области, где растворитель эффекты были сведены к минимуму 9,10. Для того, чтобы понять внутреннюю кислотно-основные свойства пептидов и белков, важно, чтобы выполнить исследования растворителей среды. Мы представляем метод для измерения кислотности олигопептидов в газовой фазе. Мы используем цистеинсодержащий олигопептиду, Ala 3 CysNH <sиЬ&gt; 2 (CH 3) в качестве модельного соединения. Измерения основаны на устоявшихся расширенного Поваров кинетический метод (рис. 1) 11-16. Эксперименты проводили с использованием тройной квадрупольный масс-спектрометр сопряжена с ионизацией электрораспылением (ESI) источник ионов (рис. 2). Для каждого образца пептида, несколько кислот менее опасными. Опорный кислоты структурно подобны органических соединений с известной газовой фазе кислотности. Раствор смеси пептида и ссылки кислоту вводят в масс-спектрометр, и в газовой фазе протон-связанной анионной кластер пептид ссылки кислота образуется. Протон-связанного кластера массы изолированы, а затем фрагментирован через индуцированных столкновениями диссоциации (CID) экспериментов. Полученное содержаний фрагмент ионов анализировали с использованием отношения между кислотностью и кластерного иона кинетики диссоциации. Газофазных кислотность пептид затем obtaiНед линейной регрессии термокинетических участков 17,18. Этот метод может быть применен к различным молекулярных систем, включая органические соединения, аминокислоты и их производные, олигонуклеотиды и олигопептидов. При сравнении газофазной кислотности измерена экспериментально с тем, рассчитанные для различных конформеров, конформационных эффектов на кислотность может быть оценена.

<ol><li> CID экспериментов вилки предоставить информацию об относительной кислотности пептида по сравнению с выбранной кислоты ссылки. Два представителя CID спектры пептидов (CH 3) с двумя ссылкой кислоты, DFAH и Мбах, показаны на фигуре 3. На фиг.3а ионов изобилие (высота пика) ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Определение газофазной кислотности цистеинсодержащий олигопептидов описано. Эксперименты проводили с использованием тройной квадрупольный масс-спектрометр. Относительное кислотности пептиды измеряют, используя столкновение-диссоциации, индуцированной экспериментов, и количественный кислотности определяются с помощью расширенного повара кинетического метода.

Определение газовой фазе кислотность олигопептидов

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

Определение Rapid высокую пропускную способность Амилоза в сублимированного образцов клубней картофеля

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

From Constructs to Crystals &amp;#8211; Towards Structure Determination of &amp;#946;-barrel Outer Membrane Proteins

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

От конструктов в кристаллах - в сторону структуры Определение β-ствольных белки наружной мембраны

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls cause an increase in viscosity (often referred to as &#39;aging&#39;) during storage of bio-oils. As such, carbonyl content has previously been used as a method of tracking bio-oil aging and condensation reactions with less variability than viscosity measurements. Additionally, carbonyls are also responsible for coke formation in bio-oil upgrading processes. Given the importance of carbonyls in bio-oils, accurate analytical methods for their quantification are very important for the bio-oil community. Potentiometric titration methods based on carbonyl oximation have long been used for the determination of carbonyl content in pyrolysis bio-oils. Here, we present a modification of the traditional carbonyl oximation procedures that results in less reaction time, smaller sample size, higher precision, and more accurate carbonyl determinations. While traditional carbonyl oximation methods occur at room temperature, the Faix method presented here occurs at an elevated temperature of 80 &#176;C.

Here we present a potentiometric titration technique for accurately quantifying carbonyl compounds in pyrolysis bio-oils.

Определение карбонильных функциональных групп в биомасла потенциометрическим титрованием: The Faix метод

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline earth-liquid metal alloys as functions of both composition and temperature in order to acquire thermodynamic data. The cell consists of a chemically stable solid-state CaF2-AF2 electrolyte (where A is the alkaline-earth element such as Ca, Sr, or Ba), with binary A-B alloy (where B is the liquid metal such as Bi or Sb) working electrodes, and a pure A metal reference electrode. Emf data are collected over a temperature range of 723 K to 1,123 K in 25 K increments for multiple alloy compositions per experiment and the results are analyzed to yield activity values, phase transition temperatures, and partial molar entropies/enthalpies for each composition.

This protocol describes the measurement of the electromotive force of alkaline-earth elements in liquid metal alloys at high temperatures (723-1,123 K) to determine their thermodynamic properties, including activity, partial molar entropy, partial molar enthalpy, and phase transition temperatures, over a wide composition range.

Определение термодинамических свойств металлических сплавов алкалической земли жидкости с использованием метода электродвижущей силы

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Распутывание сополимер высокопрочных арамидных волокон чтобы включить определение их механических свойств

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Synthesis and Structure Determination of &amp;#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Синтез и определение структуры изомеров PIIIA µ-Conotoxin с различными дисульфида связность

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Determination of the Photoisomerization Quantum Yield of a Hydrazone Photoswitch

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they are utilized in a wide variety of applications. In most studies employing photoswitches, several important photophysical properties such as maximum wavelengths of absorption and emission, molar attenuation coefficient, fluorescence lifetime, and photoisomerization quantum yield are carefully determined to investigate their electronic states and transition processes. However, measurement of the photoisomerization quantum yield, the efficiency of photoisomerization with respect to the absorbed photons, in a typical laboratory setting is often complicated and prone to error because it requires the implementation of rigorous spectroscopic measurements and calculations based on an appropriate integration method. This article introduces a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a bistable photoswitch using a photochromic hydrazone. We anticipate that this article will be a useful guide for the investigation of bistable photoswitches that are being increasingly developed.

Photoisomerization quantum yield is a fundamental photophysical property that should be accurately determined in the investigation of newly developed photoswitches. Here, we describe a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a photochromic hydrazone as a model bistable photoswitch.

Определение квантового выхода фотоизомеризации гидразонового фотопереключателя

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they ...

Анализ пестицидов в авокадо с использованием метода QuEChERS и CG-MS/MS

Determination of 45 Pesticides in Avocado Varieties by the QuEChERS Method and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Gas chromatography (GC) tandem mass spectrometry (MS/MS) stands as a preeminent analytical instrument extensively employed for the surveillance of pesticide residues in food. Nevertheless, these methods are vulnerable to matrix effects (MEs), which can potentially affect accurate quantification depending on the specific combination of analyte and matrix. Among the various strategies to mitigate MEs, matrix-matched calibration represents the prevailing approach in pesticide residue applications due to its cost-effectiveness and straightforward implementation. In this study, a total of 45 representative pesticides were analyzed in three different varieties of avocado (i.e., Criollo, Hass, and Lorena) using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate and GC-MS/MS. 
For this purpose, 5 g of the avocado sample was extracted with 10 mL of acetonitrile, and then 2.5 g of ammonium formate was added to induce phase separation. Subsequently, the supernatant underwent a cleanup process via dispersive solid-phase extraction employing 150 mg of anhydrous MgSO4, 50 mg of primary-secondary amine, 50 mg of octadecylsilane, 10 mg of graphitized carbon black, and 60 mg of a zirconium oxide-based sorbent (Z-Sep+). The GC-MS/MS analysis was successfully performed in less than 25 min. Rigorous validation experiments were carried out to assess the performance of the method. The examination of a matrix-matched calibration curve for each variety of avocado revealed that the ME remained relatively consistent and less than 20% (considered as a soft ME) for most pesticide/variety combinations. Furthermore, the method&#180;s limits of quantification were lower than 5 &#181;g/kg for all three varieties. Finally, the recovery values for most pesticides fell within the acceptable range of 70-120%, with relative standard deviation values below 20%.

Подготовка образцов авокадо по методу QuEChERS с формиатом аммония для анализа пестицидов

The present protocol describes the analysis of multiclass pesticide residues in avocado varieties using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate, followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry.