Name: determination of the gas-phase acidities of oligopeptides
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Arbetet stöddes av National Science Foundation (CHE-0.749.737). Instrumentet användningen lämnades av masspektrometri Facility vid University of the Pacific.</p

Ett. Beredning av provet Solutions <ol><li> Först förbereder stamlösningarna av peptiden och de sex syror Referens Använd ett blandat lösningsmedel av metanol och vatten i ett 01:01 volymförhållande. De stamlösningar bör ha en koncentration av ca 10 -3 M. </li><li> Väg upp ett mg av den fasta peptiden prov, A 3 CH, i ett 1,5 ml Eppendorf-rör och tillsätt 1,0 ml av blandat lösningsmedel av metanol och vatten, och blanda med hjälp av en virvel. </li><li> Väg upp ett mg av difluorätt...

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

Den framgångsrika mätning av gas-fas surhet en peptid bygger till stor del på valet av lämpliga referensvärden syror. Den idealiska referens syrorna är strukturellt liknande organiska föreningar med väletablerade gas-fas surhetsgrad värden. Referensvärdena syror bör ha liknande strukturer till varandra. Detta kommer att säkerställa en likartad entropi deprotonation för varje referens syrorna i uppsättningen. Referensvärdena syror bör ha syra värden nära de av peptiderna. För kortare cysteininnehålla...

De acidities av aminosyror är bland de viktigaste termokemiska egenskaper som påverkar strukturer, reaktivitet, och den fällbara-utspelas processer proteiner 9,19. Individuella aminosyrarester visar ofta olika effektiva acidities beroende på sina platser i proteiner. I synnerhet resterna belägna vid de aktiva ställena uppvisar ofta störs avsevärt acidities. Ett sådant exempel är cysteinresten som är bosatt i de aktiva ställena i thioredoxin super-familj av enzymer 20,21. Den aktiva cystein är ovanligt surt jämfört med dem i ovikta proteiner 3-5. Det har föreslagits att den spiralformiga konformationen kan ha ett betydande bidrag till den ovanliga surhet. Det finns omfattande experimentella undersökningar i syra-bas-egenskaper av peptider som utförs i lösningar, särskilt i vattenlösningar 2,6-8. Resultaten var ofta kompliceras av lösningsmedelseffekter7. I själva verket är de flesta av de aktiva ställena i proteiner beläget nära det inre region där lösningsmedelseffekter minimeras 9,10. För att förstå inneboende syra-bas-egenskaper av peptider och proteiner, är det viktigt att genomföra studier i ett lösningsmedel-fri miljö. Här presenterar vi en masspektrometri-metod för bestämning av gasfas-surhet. Den metod kallas den förlängda Cooks kinetisk metod. Denna metod har med framgång tillämpas på ett brett spektrum av kemiska system för bestämning av olika termokemiska egenskaper, såsom gasfas-surhet, protonen affinitet, metalljonen affinitet, elektronstrålekanonen affinitet och den joniseringsenergi 11-15, 22-26. Vi har tillämpat denna metod för att bestämma de gas-fas acidities av en serie av oligo cystein-polyalanin och cystein-polyglycin peptiderna 17,18,27. Dessa studier visar att den N-terminala cysteinet peptides är betydligt surare än motsvarande C-terminala sådana. De höga acidities av den tidigare är sannolikt på grund av de spiralformade konformationella effekterna där tiolatanjon starkt stabiliseras genom interaktion med Helix makro-dipol. På grund av den icke-flyktiga och termiskt labila naturen av peptider, är den kinetiska metoden den mest praktiska tillvägagångssätt tillgängliga för närvarande för att producera någorlunda korrekt syra-bas termokemiska mängder av peptider 28. Den allmänna ordningen och ekvationen associerat med den kinetiska metod visas i figur 1. Fastställandet av gas-fas surhet en peptid (AH) börjar med bildandet av en serie av proton-bundna kluster anjoner, [A • H • A i] ¯ (eller [A ¯ • H + • En i ¯] ¯), i jonkällan regionen av masspektrometer, där A ¯ och Aj ¯ är de deprotonerade former av peptiden ochde referensnivåer syror, respektive. De referensnivåer syror är organiska föreningar med kända gas-fas acidities. Referensvärdena syror bör ha strukturer som liknar varandra (men inte nödvändigtvis liknande den av peptiden). Likheten av strukturerna mellan referens syror säkerställer likheten mellan entropies av avprotonering bland dem. Den proton-bundna kluster anjoner är massproducerade väljs och collisionally aktiveras och därefter dissocieras användning kollision-dissociation (CID) experiment för att ge de motsvarande monomera anjoner, A ¯ och Aj ¯, med konstanterna för k och k i, respektive, som visas i fig 1a. Om sekundära splittringarna är försumbara, mängdförhållandet mellan de CID fragmentjoner, [A ¯] / [Aj ¯], representerar ett ungefärligt mått på förhållandet mellan konstanterna, k / k i. Under antagandet att det inte finns någon omvänd aktiveradion hinder för både dissociation kanaler, CID produktjon grenkvoter, ln [A ¯] / [A Jag ¯], kommer linjärt korrelerad till gasfas surhet av peptiden (Δ acid H) och för de referens-syror (Δ acid H I), som visas i figur 1b. I denna ekvation är Δ syra H avg den genomsnittliga gas-fas surhet av referens-syror, är Δ (Δ S) entropin sikt (vilket kan antas vara konstant om referens syrorna är strukturellt lika varandra), R universella gaskonstanten, och T eff är den effektiva temperaturen i systemet. Den effektiva temperaturen är en empirisk parameter som beror på flera experimentella variabler, inklusive kollisionsenergin. Värdet på gasfas-surhetsgrad bestäms genom att konstruera två uppsättningar av termo-kinetiska tomter. Den första uppsättningen är obupprätthålls genom plottning ln ([A ¯] / [Ai ¯]) mot Δ acid H i - Δ syra H avg, såsom visas i fig. 4a. Linjär regression kommer att ge en uppsättning av raka linjer med sluttningarna av X = 1 / RT EFF och fångar i Y = - [Δ acid H - Δ acid H avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R. Den andra uppsättningen tomter erhålls genom att plotta de resulterande fångar (Y) från den första uppsättningen mot motsvarande backar (X), som visas i figur 4b. Linjär regression ger en ny linje med en lutning av Δ acid H - Δ acid H avg och en skärningspunkt Δ (Δ S) / R. Värdet av Δ syra H erhålls sedan från lutningen och entropi sikt Δ (Δ S), erhålls fråninterceptet. Experimenten utförs med användning av en trippel kvadrupol masspektrometer gränssnitt till en elektrospray (ESI) jonkälla. Ett schematiskt diagram över masspektrometern visas i figur 2. De CID experiment utförs i massa välja proton-bundna kluster anjoner med den första kvadrupol enheten och låta dem genomgå kollisioner med argonatomer läckte av kollisionen kammare som hålls vid ett tryck av ca 0,5 mTorr. Dissociation produkt joner massa analyseras med den tredje quadrupole enheten. CID-spektra registreras vid flera kollisionsenergier med m / z-intervall tillräckligt bred för att täcka alla möjliga sekundära fragment. CID produkt jonintensiteter mäts genom att ställa instrumentet i den valda reaktion övervakning (SRM) läge där skanningen är inriktad på utvalda produktområden joner. CID experiment utförs vid fyra olika kollisionsenergier, motsvarandecentrum-of-massa energier (E cm) av 1,0, 1,5, 2,0, och 2,5 eV, respektive. I mitten-av-massa energi beräknas enligt följande ekvation: E cm = E lab [m / (M + m)], där E ​​lab är kollisionsenergin i laboratoriet ram, m är massan av argon, och M är massan av den proton-bundna kluster jon. I den här artikeln använder vi oligopeptiden Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som modell föreningen. C-terminalen är amiderad och tiolgruppen (SH) i cysteinresten blir det sura området. Valet av lämpliga referensvärden syrorna är avgörande för en framgångsrik mätning av gas-fas surhet. Den idealiska referens syrorna är strukturellt likartade (varandra) organiska föreningar med väletablerade gas-fas surhetsgrad värden. Referensvärdena syror bör ha syra värden nära den hos peptiderna. För peptid A 3 CH, halogenerade sex carboxylic syror väljs som referens syror. De sex referenspunkter syror är klorättiksyra (MCAH), bromättiksyra (Mbah), difluorättiksyra (DFAH), diklorättiksyra (DCAH), dibromoacetic syra (DBAH), och tri (TFAH). Två av dem, kommer DFAH och Mbah, användas för att illustrera protokollet.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Aminosyrarester belägna vid olika positioner i veckade proteiner uppvisar ofta olika grader av acidities. Till exempel är en cysteinrest belägen vid eller nära N-terminalen av en helix ofta surare än den vid eller nära C-terminalen 1-6. Även om omfattande experimentella undersökningar i syra-bas-egenskaper hos peptider har utförts i den kondenserade fasen, i synnerhet i vattenlösningar 6-8, är resultaten ofta kompliceras av lösningsmedelseffekter 7. I själva verket är de flesta av de aktiva ställena i proteiner beläget nära det inre region där lösningsmedelseffekter har minimerats 9,10. För att förstå inneboende syra-bas egenskaper hos peptider och proteiner, är det viktigt att utföra studierna i en lösningsmedelsfri miljö. Vi presenterar en metod för att mäta de acidities av oligopeptider i gasfas. Vi använder ett cysteininnehållande oligopeptid, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (A 3 CH), som modell föreningen. Mätningarna är baserade på väletablerade förlängda Cooks kinetisk metod (figur 1) 11-16. Experimenten utförs med användning av en trippel-kvadrupol masspektrometer gränssnitt med en elektrospray (ESI) jonkälla (figur 2). För varje peptid prov, finns flera referenspunkter syror valt. De referensnivåer syrorna är strukturellt liknande organiska föreningar med kända gas-fas acidities. En lösning av blandningen av peptiden och en referens-syra införes i masspektrometern, och en gas-fas proton-bunden anjonisk kluster av peptid-referens syra bildas. Den proton-bundna kluster massa isoleras och därefter fragmenterad via kollision-dissociation (CID) experiment. De resulterande fragmentjon abundances analyseras med en relation mellan acidities och klustret jon dissociation kinetik. Den gasfas surhet av peptiden är sedan obtaiNed genom linjär regression av termo-kinetiska tomter 17,18. Metoden kan tillämpas på en mängd olika molekylära system, däribland organiska föreningar, aminosyror och deras derivat, oligonukleotider och oligopeptider. Genom att jämföra gas-fas acidities mätt experimentellt med de beräknade värdena för olika konformerer kan konformationella effekter på acidities utvärderas.

<ol><li> CID gafflingsinställningarna experiment ger information om de relativa acidities av peptiden jämfört med de valda referens syror. Två representativa CID spektra av peptiden (A 3 CH) med två referens syror, DFAH och Mbah, visas i figur 3. I fig. 3a jonen överflöd (topphöjd) av peptiden jon är svagare än den för DFA ¯, och i figur 3b, är den jon överflöd av peptiden jon starkare än MBA ¯. De två spektra tyder på att gasfas surhet av peptiden är inom område...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Fastställandet av gas-fas acidities av cysteininnehållande oligopeptider beskrivs. Experimenten utförs med användning av en trippel kvadrupol masspektrometer. De relativa acidities av peptiderna mäts med kollisionen-dissociation experiment, och de kvantitativa acidities fastställs med utökade Cooks kinetisk metod.

Fastställande av gasfas Acidities av Oligopeptider

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rapid hög genomströmning Amylos Bestämning i frystorkad potatisknöl Prover

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Struktur och samordning Fastställande av peptid-metallkomplex Använda 1D och 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildning av Beställda Biomolecular Structures av självorganisering av korta peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

Från konstruktioner till kristaller - Mot strukturbestämning av β-fat yttermembranproteiner

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Fastställande av karbonylsulfid funktionella grupper i Biooljor genom potentiometrisk titrering: Den Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

Bestämning av termodynamiska egenskaper av alkaliska jord-flytande metallegeringar med elektromotorisk kraft-tekniken

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Förgrymmat höghållfasta sampolymer Aramid fibrer för att möjliggöra bestämning av mekaniska egenskaper

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Syntes och strukturbestämning av µ-Conotoxin PIIIA isomerer med olika disulfid Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Jon mobilitet-masspektrometri tekniker för att bestämma strukturen och mekanismerna för metall Jon igenkänning och redox aktivitet av metall bindning Oligopeptides