Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Wij danken James Clark voor het verstrekken van gegevens van dieren bij verschillende ontwikkelingsstadia tijdstippen. C. elegans stammen in deze studie werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center, die wordt ondersteund door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dit werk werd ondersteund door CIRG 1817 van CUNY naar JL en CSD, en door NIH 1R15GM073678-01 en 1R15GM097692-01 tot CSD Wij danken dr. William J Rice, Dr Nathalia Holtzman, en Melissa Silvestrini voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd uitgevoerd in gedeeltelijke vervulling van de vereisten voor een PhD-graad van de Graduate Center van de City University van New York (S. Xiong).

1. Het voorbereiden van RNAi voeden Platen uitvoeren Target gensequentie <ol><li> Bij gebruik van in de handel verkrijgbare RNAi bibliotheken (bijv. vanuit de Bron BioScience LifeSciences), ga dan verder met stap 1.4. U kunt ook klonen target-gen-sequenties in vector L4440, een veelgebruikte worm RNAi plasmide 8, door standaard klonen protocol. </li><li> Transformeren het recombinant plasmide in bacteriële stam HT115 (DE3) kweken ervan op LB-agarplaten met 25 mg / ml carbenicilline en 12,5 pg / ml...

<ol>
	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo.">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li><li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi.">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF&#946;+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans.">The expression of TGF&#946; signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling.">TGF-&#946; signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li><li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evo-devo:+variations+on+ancestral+themes.">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

In dit protocol beschrijven we onze methode voor de identificatie van lichaamsgrootte defectieve mutanten van C. elegans door RNAi voeden. Deze methode is van toepassing op de identificatie van TGF-β uitschakeling. Aangezien dergelijke onderdelen worden geconserveerd door evolutie 15, zoals schermen relevant zijn voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van TGF-β signalering in alle metazoa. Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een dergelijk scherm is de uitgangsstam. We hebbe...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi worm platen 17,7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Voeg H 2 O tot 3 liter. Autoclaveren. Voeg 3 ml 1M IPTG (steriel) en 3 ml 25 mg / ml carbenicilline (steriel) giet in 60 mm petrischalen. Worm platen 17,7 g Worm Medium Mix 0,6 g streptomycinesulfaat 60 g Agar Voeg H 2 O tot 3 liter. Autoclaveren. Giet het mengsel in 60 mm petrischalen. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg cholesterol 200 g NaCl Meng grondig en zorgt ervoor dat brokken voorkomen, dit poedervormig mengsel kan worden opgeslagen gedurende vele maanden voor gebruik. 2% agarose 0,5 g Agarose Advertentied 25 ml dH 2 O. Hitte in de magnetron totdat het is opgelost. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Los IN10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN3 Voeg dH 2 O tot 100 ml 25 mM NaN3 2,5 ml 1M NaN 3 Voeg dH 2 O tot 100 ml Caenorhabditis elegans van Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmide (draagt ​​ampicilline-resistentiegen) Bacteriënstam HT115 (DE3) (bevat IPTG induceerbare T7 polymerase, deficiënt voor RNAse III-gen (a dsRNAse) waarop ook tetracycline-resistentiegen) 16 60 mm Petrischalen 100 mm Petrischalen 14 ml ronde bodem Falcon kweekbuisjes objectglaasjes dekglaasjes 1 tot 20 ul pipet 20 tot 200 ul pipet 200-1000 ulpipet 1 tot 200 ul pipet tips 200-1000 ul pipet tips 1,5 ml Eppendorf buisjes platina draad worm pick </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Dubbelstrengs RNA-gemedieerde interferentie (RNAi) is een effectieve strategie om knock down doelwit genexpressie 1-3. Het is toegepast op vele modelsystemen zoals planten, invertebraten en vertebraten. Er zijn verschillende methoden om RNAi bereiken in vivo 4,5. Bijvoorbeeld, het doelwitgen kan worden omgezet in een RNAi vector, en vervolgens permanent of tijdelijk omgezet in cellijnen of primaire cellen gen knockdown effecten te bereiken, als alternatief gesynthetiseerde dubbelstrengs oligonucleotiden van specifieke doelgenen (RNAi oligos) kan tijdelijk worden omgezet in cellijnen of primaire cellen doelgenen zwijgen, of gesynthetiseerde dubbelstrengs RNA moleculen worden gemicroinjecteerd in een organisme. Aangezien de nematode C. elegans gebruikt bacteriën als een bron van voedsel, het voeden van de dieren met bacteriën die dubbel-strengs RNA tegen target genen biedt een levensvatbare strategie 6. Hier presenteren we een RNAi voedenmethode om lichaamsgrootte fenotype scoren. Lichaamsgrootte in C. elegans wordt primair gereguleerd door de TGF-β - zoals ligand DBL-1, zodat deze test is geschikt voor identificatie van TGF-β signaleringscomponenten 7. We verschillende stammen gebruikt, waaronder twee RNAi overgevoelig stammen aan de RNAi voeden experimenten te herhalen. Onze resultaten laten zien dat RRF-3 stam gaf ons de beste verwachte RNAi fenotype. De methode is eenvoudig uit te voeren, reproduceerbare en gemakkelijk gekwantificeerd. Verder is onze protocol minimaliseert het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, dus het is geschikt voor kleinere laboratoria of aan degenen met voornamelijk undergraduate instellingen.

In ons onderzoek richten we ons op de lichaamsgrootte regulering door de DBL-1/TGF-β pad. Het verlies van functie van de DBL-1-route resulteert in kleine lichaamsgewicht, met een kortere lengte vergeleken met wild-type dieren 7,10,11. Zo schermen voor C. elegans lichaamsgrootte mutanten kunnen identificeren TGF-β signalering componenten en modificatoren. DBL-1-signalering wordt gemedieerd door een geconserveerd TGF-β signaaltransductieroute die celoppervlak receptoren en intracellulaire Smad signa...

Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype in<em&gt; C. elegans</em&gt;. Deze methode kan worden gebruikt voor een grote scherm potentiële genetische componenten van belang, zoals die welke in lichaamsgrootte regulering door DBL-1/TGF-β signalering identificeren.

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Grootschalige Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...