Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Nous remercions James Clark pour fournir des figures d&#39;animaux à différents points dans le temps de développement. C. souches elegans dans cette étude ont été obtenues à partir du Centre de Caenorhabditis Genetics, qui est soutenu par le Centre National de Ressources NIH Research (NCRR). Ce travail a été soutenu par CIRG 1817 à partir de CUNY à JL et CDD, et par le NIH 1R15GM073678-01-01 et 1R15GM097692 à la CDD Nous remercions le Dr William J Rice, le Dr Nathalia Holtzman, et Mélissa Silvestrini pour les commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été réalisé dans l&#39;accomplissement partiel des exigences d&#39;un doctorat de la Graduate Center de la City University of New York (S. Xiong).

1. Préparation des plaques d&#39;alimentation ARNi séquence porteuse gène cible <ol><li> Si vous utilisez les bibliothèques disponibles dans le commerce ARNi (par exemple à partir de LifeSciences Source BioScience), passez à l&#39;étape 1.4. Alternativement, cloner des séquences de gènes cibles dans le vecteur L4440, un ver couramment utilisé ARNi plasmide 8, par protocole de clonage standard. </li><li> Transformer le plasmide recombinant dans la souche bactérienne HT115 (DE3), la cultur...

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	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo.">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li><li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi.">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li><li>Kamath, R. 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Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evo-devo:+variations+on+ancestral+themes.">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

Dans ce protocole, nous décrivons notre méthode pour l&#39;identification des mutants défectueux de la taille du corps C. elegans par l&#39;alimentation ARNi. Cette méthode est applicable à l&#39;identification des composants de signalisation du TGF-β. Depuis ces composants sont hautement conservées à travers l&#39;évolution 15, ces écrans sont pertinents pour élucider les mécanismes moléculaires de la signalisation du TGF-β dans tous les métazoaires. Une considération importante dans...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Plaques à vis sans fin ARNi 17,7 g Mélanger moyen Worm 60 g Agar Ajouter H 2 O à 3 litres. Autoclave. Ajouter 3 ml d&#39;IPTG 1M (stérile) et 3 ml 25 mg / ml carbénicilline (stérile), puis verser dans des boîtes de 60 mm de Pétri. Plaques à vis sans fin 17,7 g Mélanger moyen Worm 0,6 g de sulfate de streptomycine 60 g Agar Ajouter H 2 O à 3 litres. Autoclave. Verser dans 60 boîtes de Pétri mm. Mix Moyen Worm 55 g de Tris-Cl 24 g de Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg de cholestérol 200 g de NaCl Mélanger soigneusement et veillez à éviter les morceaux, ce mélange en poudre peut être conservée pendant de nombreux mois avant de les utiliser. Agarose à 2% 0,5 g d&#39;agarose Annonced 25 ml dH 2 O. La chaleur au micro-ondes jusqu&#39;à dissolution. 1M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissoudre in10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g de NaN3 Ajouter dH 2 O à 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Ajouter dH 2 O à 100 ml Caenorhabditis elegans de Caenorhabditis du Genetics Center L4440 plasmide (porte résistance à l&#39;ampicilline gène) Souche de bactéries HT115 (DE3) (contient IPTG polymérase T7 inductible; déficient pour la RNAse III gène (dsRNase) qui porte également la tétracycline gène de résistance) 16 60 mm boîtes de Pétri 100 mm boîtes de Pétri 14 ml à fond rond tubes de culture Falcon lames de verre lamelles de verre 1-20 pipette ul 20-200 ul pipette 200-1000 ulpipette 1-200 embouts de pipette ul 200-1000 embouts de pipette ul Tubes Eppendorf de 1,5 ml choix ver fil de platine </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Double-brin d&#39;ARN médiée par interférence (ARNi) est une stratégie efficace pour faire tomber l&#39;expression du gène cible 1-3. Il a été appliqué à de nombreux systèmes modèles, y compris les plantes, les invertébrés et les vertébrés. Il existe différentes méthodes pour atteindre 4,5 ARNi in vivo. Par exemple, le gène cible peut être transformé en un vecteur d&#39;ARNi, puis de façon permanente ou transitoire transformé dans des lignées cellulaires ou des cellules primaires pour obtenir des effets inactivation génique; bien synthétisées oligonucléotides double brin de gènes cibles spécifiques (ARNi oligos) peut être transitoirement dans des lignées cellulaires transformées ou des cellules primaires pour réduire au silence des gènes cibles, ou double-brin synthétisé les molécules d&#39;ARN peuvent être micro-injectées dans l&#39;organisme. Depuis le nématode C. elegans utilise des bactéries comme source de nourriture, nourrir les animaux avec des bactéries exprimant double-brin d&#39;ARN contre les gènes cibles fournit une stratégie viable 6. Nous présentons ici une alimentation ARNiméthode pour marquer phénotype taille du corps. Taille du corps chez C. elegans est régulée principalement par le TGF-β - ligand comme DBL-1, si ce test est approprié pour l&#39;identification du TGF-β composants de signalisation 7. Nous avons utilisé différentes souches dont deux souches ARNi hypersensibles à répéter les expériences d&#39;alimentation ARNi. Nos résultats ont montré que far-3 souche nous a donné le meilleur phénotype attendu ARNi. La méthode est facile à réaliser, reproductible et facilement quantifiables. En outre, notre protocole minimise l&#39;utilisation de l&#39;équipement spécialisé, il est donc approprié pour les petits laboratoires ou les établissements majoritairement de premier cycle.

Dans notre recherche, nous nous concentrons sur la réglementation taille du corps par la voie DBL-1/TGF-β. La perte de fonction des résultats voie DBL-1 dans une petite taille, y compris une longueur plus courte du corps par rapport à des animaux de type sauvage 7,10,11. Ainsi, écrans pour C. elegans mutants taille du corps sont capables d&#39;identifier les composants de signalisation TGF-β et de modificateurs. DBL-1 signalisation est médiée par une conservée TGF-β voie de transduction de ...

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Nous montrons comment utiliser la technique d&#39;alimentation ARNi pour abattre gènes cibles et le phénotype taille score de corps<em&gt; C. elegans</em&gt;. Cette méthode pourrait être utilisée pour un écran à grande échelle pour identifier les éventuels composants génétiques d&#39;intérêt, tels que ceux qui sont impliqués dans la régulation de la taille du corps par la signalisation DBL-1/TGF-β.

En utilisant l&#39;ARN médiée par la stratégie d&#39;alimentation interférences à l&#39;écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

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