Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Wir danken James Clark für die Bereitstellung Figuren von Tieren in verschiedenen Entwicklungs-Zeitpunkten. C. elegans-Stämme in dieser Studie wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, das durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) getragen wird erhalten. Diese Arbeit wurde von CIRG 1817 vom CUNY JL und CSD unterstützt und durch NIH 1R15GM073678-01 und 1R15GM097692-01 bis CSD Wir danken Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman und Melissa Silvestrini für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde in teilweiser Erfüllung der Anforderungen für eine Promotion an der Graduate Center der City University of New York (S. Xiong) durchgeführt.

Ein. Vorbereiten RNAi Feeding Plates Tragen Zielgensequenz <ol><li> Bei der Verwendung von kommerziell erhältlichen RNAi-Bibliotheken (zB von Quelle BioScience LifeSciences), fahren Sie mit Schritt 1.4. Alternativ klonen Target-Gensequenzen in Vektor L4440, ein häufig verwendetes Wurm RNAi Plasmid 8, Standard-Klonen Protokoll. </li><li> Verwandeln Sie das rekombinante Plasmid in Bakterienstamm HT115 (DE3), Kultur sie auf LB-Agar-Platten mit 25 ug / ml Carbenicillin und 12,5 pg / ml Tetracyclin, u...

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	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. 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L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir unsere Methode zur Identifizierung von Körpergröße Defektmutanten von C. elegans durch RNAi Fütterung. Dieses Verfahren ist anwendbar auf die Identifizierung von TGF-β-Signalisierung Komponenten. Da diese Komponenten stark durch Evolution 15 konserviert sind, sind solche Bildschirme relevant zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der TGF-β-Signalisierung in allen Metazoen. Eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung eines solchen Bildschirms ist der Aus...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi-Wurm Platten 17,7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Hinzufügen H 2 O bis 3 Liter. Autoklavieren. 3 ml 1M IPTG (steril) und 3 ml 25 mg / ml Carbenicillin (steril), dann gießen Sie in 60 mm Petrischalen. Worm Platten 17,7 g Worm Medium Mix 0,6 g Streptomycinsulfat 60 g Agar Hinzufügen H 2 O bis 3 Liter. Autoklavieren. Gießen Sie in 60 mm Petrischalen. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterin 200 g NaCl Gründlich mischen und achten Sie darauf, Stücke zu vermeiden, das pulverisierte Mischung kann für viele Monate vor der Verwendung gelagert werden. 2% Agarose 0,5 g Agarose Anzeiged 25 ml dH 2 O. Hitze in der Mikrowelle bis zur Auflösung. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) 2 g IPTG Lösen in10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN 3 Hinzufügen dH 2 O auf 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Hinzufügen dH 2 O auf 100 ml Caenorhabditis elegans aus Caenorhabditis Genetics Center L4440 Plasmid (trägt Ampicillinresistenzgen) Bakterien-Stamm HT115 (DE3) (enthält IPTG induzierbaren T7-Polymerase; defizient für RNAse III-Gen (a dsRNAse), das auch für Tetracyclin-Resistenz-Gen) 16 60 mm Petrischalen 100 mm Petrischalen 14 ml Rundkolben Falcon Kulturröhrchen Glasobjektträger Deckgläschen 1-20 ul Pipette 20-200 ul Pipette 200-1000 ulPipette 1-200 ul Pipettenspitzen 200-1000 ul Pipettenspitzen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen Platindraht Wurm Pick </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Doppel-Strang-RNA-Interferenz (RNAi) ist eine effektive Strategie, um knock down Zielgenexpression 1-3. Es wurde in viele Modellsysteme einschließlich Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren angewendet worden. Es gibt verschiedene Methoden, um RNAi in vivo 4,5 zu erreichen. Zum Beispiel kann das Ziel-Gen kann in einen RNAi Vektor transformiert werden und dann entweder dauerhaft oder transient in Zelllinien oder primäre Zellen nach Gens Knockdown Effekte zu erzielen transformiert, alternativ synthetisierte doppelsträngige Oligonukleotide aus spezifischer Zielgene (RNAi Oligos) kann transient sein transformiert, in Zelllinien oder primäre Zellen nach Zielgene Schweigen; oder synthetisierten Doppelstrang-RNA-Moleküle können in einen Organismus mikroinjiziert werden. Seit dem Fadenwurm C. elegans verwendet Bakterien als Nahrungsquelle, die Fütterung der Tiere mit Bakterien, die doppelsträngige RNA gegen Zielgene bietet eine tragfähige Strategie 6. Hier präsentieren wir eine RNAi FütterungMethode punkten Körpergröße Phänotyp. Körpergröße in C. elegans primär durch die TGF-β reguliert wird - wie Ligand DBL-1, so dass dieser Assay geeignet ist zur Identifizierung von TGF-β Signalkomponenten 7. Wir verwendeten verschiedene Stämme, darunter zwei RNAi überempfindlich Stämme, die RNAi Fütterungsversuche wiederholen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass rrf-3-Stamm gab uns die besten erwarteten RNAi Phänotyp. Die Methode ist einfach durchzuführen, reproduzierbar und leicht zu quantifizieren. Darüber hinaus minimiert unser Protokoll die Verwendung von Spezialgeräten, so ist es für kleinere Laboratorien oder jenen an überwiegend Bachelor-Institutionen.

In unserer Forschung konzentrieren wir uns auf die Körpergröße der Regulierung durch die DBL-1/TGF-β Weg. Der Verlust der Funktion der DBL-1-Weg führt zu geringe Körpergröße, einschließlich einer kürzeren Körper Länge im Vergleich mit Wildtyp-Tieren 7,10,11. So Bildschirme für C. elegans Körpergröße Mutanten, imstande sind, TGF-β-Signalisierung Komponenten und Modifikatoren. DBL-1-Signalisierung wird durch eine konservierte TGF-β Signalübertragungswegs, die Zelloberflächen-Rezepto...

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Wir zeigen, wie die RNAi Fütterung Technik nutzen, um knock down Zielgene und Gäste Körpergröße Phänotyp<em&gt; C. elegans</em&gt;. Dieses Verfahren könnte für eine großtechnische Bildschirm verwendet werden, um potenzielle genetische Komponenten von Interesse, wie sie beispielsweise in der Körpergröße Regulierung durch DBL-1/TGF-β Signalgebung beteiligt sind.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Forschung

Biologie

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...