Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
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हम विभिन्न विकासात्मक समय अंक पर पशुओं के आंकड़े उपलब्ध कराने के लिए जेम्स क्लार्क सी. धन्यवाद. इस अध्ययन में एलिगेंस उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर, जो अनुसंधान संसाधन के लिए NIH राष्ट्रीय केंद्र (NCRR) द्वारा समर्थित है से प्राप्त किया गया. यह काम 1817 CIRG CUNY से जीएल और सीएसडी समर्थित किया गया था, और NIH 1R15GM073678-01 और सीएसडी के लिए 1R15GM097692-01 के द्वारा हम पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए डॉ. विलियम जे चावल, डॉ. Nathalia Holtzman, और मेलिस्सा Silvestrini धन्यवाद. न्यूयॉर्क के सिटी विश्वविद्यालय (एस Xiong) के ग्रेजुएट केंद्र से पीएचडी की डिग्री के लिए आवश्यकताओं की आंशिक पूर्ति में इस काम से बाहर किया गया था.

1. आरएनएआई दूध पिलाने लक्ष्य जीन अनुक्रम उठाते प्लेट्स की तैयारी <ol><li> व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनएआई पुस्तकालयों (जैसे स्रोत बायोसाइंस जीव विज्ञान से) का उपयोग अगर, 1.4 कदम आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप स?...

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	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. 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E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF&#946;+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans.">The expression of TGF&#946; signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling.">TGF-&#946; signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li><li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evo-devo:+variations+on+ancestral+themes.">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में, हम शरीर सी. के आकार दोषपूर्ण म्यूटेंट के पहचान के लिए हमारे विधि का वर्णन आरएनएआई खिला द्वारा एलिगेंस. इस विधि TGF-बीटा संकेत घटकों की पहचान करने के लिए लागू है. चूंकि ऐसे घटकों अत्...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> आरएनएआई कीड़ा प्लेटों 17.7 छ कृमि मध्यम मिक्स 60 ग्राम अग्रवाल 3 लीटर एच 2 हे जोड़ें. आटोक्लेव. 3 मिलीलीटर 1M (बाँझ) IPTG और 3 मिलीग्राम 25 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन (बाँझ) जोड़ें, तो 60 मिमी पेट्री डिश में डाल देना. कृमि प्लेटें 17.7 छ कृमि मध्यम मिक्स 0.6 छ स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट 60 ग्राम अग्रवाल 3 लीटर एच 2 हे जोड़ें. आटोक्लेव. 60 मिमी पेट्री डिश में डालो. कृमि मध्यम मिक्स 55 Tris Cl छ 24 Tris-OH छ 310 छ Bacto peptone 800 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल 200 ग्राम NaCl अच्छी तरह मिक्स और विखंडू से बचने के लिए सुनिश्चित हो सकता है, यह पाउडर मिश्रण उपयोग करने के लिए कई महीने पहले के लिए भंडारित किया जा सकता है. 2% agarose 0.5 ग्राम agarose विज्ञापनd 25 मिलीलीटर DH 2 ओ माइक्रोवेव में गर्म जब तक भंग. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 ग्राम IPTG IN10 मिलीलीटर DH 2 हे भंग 1M 3 NaN 6.5 छ NaN 3 DH 2 हे 100 मिलीलीटर जोड़ें 25 मिमी NaN 3 2.5 मिलीलीटर 1M NaN 3 DH 2 हे 100 मिलीलीटर जोड़ें Caenorhabditis एलिगेंस Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र से L4440 प्लाज्मिड (एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन किया जाता है) 16, जीवाणु HT115 (DE3) (RNase III (एक dsRNAse) जीन जो भी टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध जीन वहन के लिए कमी IPTG inducible T7 पोलीमरेज़ शामिल) तनाव 60 मिमी पेट्री डिश 100 मिमी पेट्री डिश 14 मिलीलीटर दौर नीचे फाल्कन संस्कृति ट्यूबों कांच स्लाइड कांच coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μlpipettor 1-200 μl pipet सुझावों 200-1000 μl pipet सुझावों 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों प्लैटिनम तार कीड़ा लेने </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

डबल किनारा हस्तक्षेप आरएनए की मध्यस्थता (आरएनएआई) एक प्रभावी रणनीति के लिए नीचे लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 1-3 दस्तक है. यह संयंत्र अकशेरूकीय और रीढ़ सहित कई मॉडल प्रणाली को लागू किया गया है. 4,5 vivo में आरएनएआई को प्राप्त करने के विभिन्न तरीके हैं. उदाहरण के लिए, लक्ष्य जीन एक आरएनएआई वेक्टर के रूप में तब्दील किया जा सकता है, और फिर या तो स्थायी रूप से या transiently सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं जीन पछाड़ना प्रभाव को प्राप्त करने में तब्दील, वैकल्पिक रूप से विशिष्ट लक्ष्य जीन (आरएनएआई oligos) से डबल भूग्रस्त oligonucleotides संश्लेषित transiently हो सकता है सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं को लक्ष्य जीन चुप्पी में तब्दील हो, या संश्लेषित डबल भूग्रस्त आरएनए अणुओं एक जीव में microinjected किया जा सकता है. चूंकि निमेटोड सी. एलिगेंस एक खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया का उपयोग करता है, बैक्टीरिया लक्ष्य जीन के खिलाफ डबल भूग्रस्त आरएनए व्यक्त के साथ पशुओं को खिला एक व्यवहार्य 6 रणनीति प्रदान करता है. यहाँ हम एक आरएनएआई खिला मौजूदविधि शरीर के आकार phenotype स्कोर करने के लिए. सी. में शारीरिक आकार एलिगेंस TGF-β द्वारा मुख्य रूप से नियंत्रित किया जाता है की तरह ligand DBL-1, तो इस परख TGF-बीटा संकेत 7 घटकों की पहचान के लिए उपयुक्त है. हम दो आरएनएआई अत्यंत अनुभुत आरएनएआई खिला प्रयोगों दोहराने उपभेदों सहित अलग अलग उपभेदों का इस्तेमाल किया. हमारे नतीजे बताते हैं कि तनाव rrf-3 हमें सबसे अच्छा उम्मीद आरएनएआई phenotype दिया. विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और आसानी से मात्रा निर्धारित है. इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल विशेष उपकरणों का उपयोग कम से कम है, तो यह छोटी प्रयोगशालाओं या मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में उन लोगों के लिए उपयुक्त है.

अपने शोध में, हम शरीर DBL-1/TGF-β मार्ग द्वारा विनियमन आकार पर ध्यान केंद्रित. DBL-1 छोटे शरीर के आकार में मार्ग परिणाम एक छोटी शरीर जंगली प्रकार 7,10,11 जानवरों के साथ तुलना में लंबाई सहित, के समारोह के नुकसान. स...

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

हम प्रदर्शन कैसे आरएनएआई खिला तकनीक का उपयोग करने के लिए नीचे में लक्ष्य जीन और स्कोर शरीर के आकार के phenotype दस्तक<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt;. इस विधि एक बड़े पैमाने स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए ब्याज की संभावित आनुवंशिक शरीर DBL-1/TGF-β संकेतन द्वारा विनियमन आकार में शामिल उन लोगों के रूप में इस तरह के घटकों की पहचान.

निमेटोड में शारीरिक आकार विनियमन में शामिल जीनों के लिए स्क्रीन के लिए आरएनए की मध्यस्थता हस्तक्षेप दूध पिलाने की रणनीति का प्रयोग कर<em&gt; सी. एलिगेंस</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

सी एलिगेंस Dopamine न्यूरॉन अध: पतन परख की संभावित पार्किंसंस रोग जीन की मान्यता के लिए आवेदन

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribosome बाध्य नवजात polypeptides का अलगाव<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; MRNA के साथ translational रोकें ब्लॉग की पहचान के लिए

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

SECM गिरफ्तार अनुक्रम एक ribosome बाध्य polypeptides पृथक उपकरण के रूप में का उपयोग

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

एंटीबॉडी धुंधला में<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; &quot;रुक क्रैकिंग&quot; का प्रयोग

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

बड़े पैमाने पर जीन पछाड़ना में<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; मजबूत घाटे का समारोह phenotypes उत्पन्न करने के लिए dsRNA दूध पिलाने पुस्तकालयों का उपयोग

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

तरीके में पेशी के subcellular डिब्बों का आकलन करने के लिए<em&gt; सी. एलिगेंस</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

हाइड्रा में glutathione प्रेरित दूध पिलाने की प्रतिक्रिया को मापने

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

में विकास की प्रक्रिया पर नज़र रखने और बढ़ाता<em&gt; सी। एलिगेंस</em&gt; खुले स्रोत उपकरण का उपयोग

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

सी एलिगेंस में भागा पेप्टाइड विषाक्तता को मापने

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...