Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
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Ringraziamo James Clark per la fornitura di figure di animali in vari momenti dello sviluppo. C. ceppi elegans in questo studio sono stati ottenuti dalla Genetics Caenorhabditis Center, che è supportato dal National Center for NIH Research (NCRR). Questo lavoro è stato sostenuto da CIRG 1817 della CUNY a JL e CSD, e dal NIH 1R15GM073678-01 e 1R15GM097692-01 al CSD Ringraziamo il Dott. William J. Rice, il dottor Nathalia Holtzman, e Melissa Silvestrini per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato svolto in adempimento parziale dei requisiti per un dottorato di ricerca del Graduate Center della City University di New York (S. Xiong).

1. Preparazione di piastre di alimentazione RNAi trasporto Gene sequenza bersaglio <ol><li> Se si utilizzano le librerie disponibili in commercio (ad esempio da RNAi LifeSciences Fonte BioScience), passare al punto 1.4. In alternativa, clonare sequenze di geni bersaglio in vettoriale L4440, un worm comunemente usato RNAi plasmide 8, dal protocollo standard di clonazione. </li><li> Trasformare il plasmide ricombinante in ceppo batterico HT115 (DE3), cultura loro su piastre di agar LB con 25 ug / ml ...

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	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. 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L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

In questo protocollo, si descrive il nostro metodo per l&#39;identificazione di mutanti difettosi delle dimensioni del corpo C. elegans di alimentazione RNAi. Questo metodo è applicabile alla identificazione di TGF-β componenti segnalazione. Dal momento che tali componenti sono altamente conservati nel corso dell&#39;evoluzione 15 schermi che abbiano una connessione a chiarire i meccanismi molecolari di TGF-β segnalazione in tutti i metazoi. Una considerazione importante nel progettare tale scherm...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi vermi piatti 17,7 g Worm Mix Media 60 g Agar Aggiungi H 2 O a 3 litri. Autoclave. Aggiungere 3 ml 1M IPTG (sterile) e 3 ml 25 mg / ml Carbenicillin (sterile), poi versare in piastre di Petri da 60 mm. Worm piastre 17,7 g Worm Mix Media 0,6 g streptomicina solfato 60 g Agar Aggiungi H 2 O a 3 litri. Autoclave. Versare in piastre Petri da 60 mm. Worm Media Mix 55 g di Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto peptone 800 mg Colesterolo 200 g NaCl Agitare bene e essere sicuri di evitare blocchi, questa miscela in polvere può essere conservato per molti mesi prima dell&#39;uso. 2% agarosio 0,5 g di agarosio Annunciod 25 ml dH 2 O. Il calore nel forno a microonde fino a completa dissoluzione. 1M isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) 2 g IPTG Sciogliere IN10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN 3 Aggiungi dH 2 O a 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Aggiungi dH 2 O a 100 ml Caenorhabditis elegans di Caenorhabditis Genetica Centro L4440 plasmide (porta ampicillina gene per la resistenza) Batteri ceppo HT115 (DE3) (contiene IPTG inducibile T7 polimerasi, carente per RNAsi III gene (a dsRNAse) che porta anche tetraciclina gene per la resistenza) 16 60 millimetri Petri piatti 100 millimetri Petri piatti 14 ml a fondo tondo Falcon cultura tubi diapositive di vetro vetro coprioggetti 1-20 microlitri pipetta 20-200 microlitri pipetta 200-1000 microlitripipetta 1-200 puntali ul 200-1000 puntali ul 1,5 ml provette Eppendorf filo di platino scelta vite senza fine </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Doppio filamento di RNA-mediata interferenza (RNAi) è una strategia efficace per abbattere l&#39;espressione del gene bersaglio 1-3. Esso è stato applicato a sistemi modello molti tra piante, invertebrati e vertebrati. Ci sono vari metodi per raggiungere RNAi in vivo 4,5. Ad esempio, il gene bersaglio può essere trasformato in un vettore RNAi, e quindi permanentemente o transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per ottenere effetti atterramento gene; alternativamente sintetizzati oligonucleotidi a doppio filamento da geni specifici (oligo RNAi) può essere transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per mettere a tacere i geni bersaglio, o di sintesi del doppio filamento molecole di RNA possono essere microiniettato in un organismo. Poiché il nematode C. elegans utilizza batteri come fonte di cibo, nutrire gli animali con i batteri che esprime a doppio filamento di RNA contro geni bersaglio fornisce una strategia sostenibile 6. Qui vi presentiamo una alimentazione RNAimetodo per segnare dimensioni fenotipo corpo. Taglia corpo in C. elegans è regolato principalmente dal TGF-β - come ligando DBL-1, quindi questo saggio è appropriato per l&#39;identificazione dei componenti di segnalazione TGF-β 7. Abbiamo usato diversi ceppi tra due ceppi ipersensibili RNAi per ripetere gli esperimenti di alimentazione RNAi. I nostri risultati hanno dimostrato che RRF-3 ceppo ci ha dato il miglior fenotipo atteso RNAi. Il metodo è di facile esecuzione, riproducibile e facilmente quantificato. Inoltre, il nostro protocollo minimizza l&#39;uso di attrezzature specializzate, quindi è adatto per piccoli laboratori o quelli a istituzioni prevalentemente universitari.

Nella nostra ricerca, ci concentriamo sulla regolamentazione dimensioni del corpo attraverso la via DBL-1/TGF-β. La perdita di funzione delle DBL-1 risultati della via in dimensioni contenute, tra cui una lunghezza del corpo più breve rispetto a wild-type animali 7,10,11. Così, protezioni per C. elegans mutanti dimensioni del corpo sono in grado di identificare TGF-β componenti di segnalazione e modificatori. DBL-1 segnalazione è mediata da una conservata TGF-β pathway di trasduzione del segnal...

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Abbiamo dimostrato come utilizzare la tecnica di alimentazione RNAi per abbattere i geni bersaglio e corpo fenotipo punteggio dimensione in<em&gt; C. elegans</em&gt;. Questo metodo può essere utilizzato per uno schermo grande scala per identificare potenziali componenti genetiche di interesse, come quelli coinvolti nella regolazione dimensioni del corpo tramite segnalazione DBL-1/TGF-β.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

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