Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

我々は、様々な発達の時点で動物の姿を提供するためJames Clark氏に感謝します。C.本研究ではエレガンス株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によってサポートされ線虫遺伝学センターから入手した。この作品は、ニューヨーク市立大学からJLとCSDにCIRG 1817でサポートされていた、とNIH 1R15GM073678-01およびCSDへ1R15GM097692-01で我々は、原稿上のコメントのための博士ウィリアム·J·ライス博士ナタリアホルツマン、とメリッサSilvestriniに感謝します。この作品は、ニューヨーク市立大学（S.熊）の大学院センターから博士号のための要件の部分的な達成で行った。

1。標的遺伝子配列を運ぶのRNAi給餌プレートの準備<ol><li>市販のRNAiライブラリー（ 例えば、ソースバイオサイエンスライフサイエンスから）使用している場合は、1.4に進みます。代わりに、標準的なクローニングプロトコルによって、ベクトルL4440、8 RNAiのプラスミド、一般的に使用されるワームに標的遺伝子配列のクローンを作成します。 </li><li>細菌株HT115（DE3）を、25μg/...

<ol>
	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo.">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li><li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi.">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF&#946;+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans.">The expression of TGF&#946; signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling.">TGF-&#946; signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li><li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evo-devo:+variations+on+ancestral+themes.">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

このプロトコルでは、Cのボディサイズ欠損変異株の同定のための私達の方法を記述RNAiの給餌によってエレガンス 。この方法では、TGF-βシグナル伝達コンポーネントの識別にも適用可能である。このような成分が高度に進化15を介して保存されているので、このような画面は、すべての後生動物ではTGF-βシグナル伝達の分子機構の解明に関連しています。このような画面...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAiのワームプレート 17.7グラムのWORMメディアミックス 60グラム寒天 3リットルにH 2 Oを追加します。オートクレーブ。 3ミリリットル1M IPTG（滅菌）および3ml 25 mg / mlのカルベニシリンを（滅菌）を追加してから、60ミリメートルペトリ皿に注ぐ。 ワームプレート 17.7グラムのWORMメディアミックス 0.6グラムの硫酸ストレプトマイシン 60グラム寒天 3リットルにH 2 Oを追加します。オートクレーブ。 60ミリメートルペトリ皿に注ぐ。 WORMメディアミックス 55グラムのトリス-Cl 24グラムのトリス-OH 310グラムバクトペプトン 800mgのコレステロール 200グラムのNaCl 徹底的に混ぜるとチャンクを避けるようにしてください、この粉末の混合物を使用する前に何ヶ月も保存することができます。 2％アガロース 0.5グラムアガロース 広告dは25ミリリットルのdH 2 O電子レンジでの加熱溶解するまで。 1Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG） 2グラムのIPTG IN10ミリリットルdH 2 Oを溶かす 1MのNaN 3 6.5グラムのNaN 3 100mlにdH 2 Oを追加 25mMのNaN 3を 2.5ミリリットル1MのNaN 3 100mlにdH 2 Oを追加 線虫の遺伝学センターから線虫（Caenorhabditis elegans） プラスミドL4440（アンピシリン耐性遺伝子を運ぶ） 菌株HT115（DE3）（IPTG誘導性T7ポリメラーゼを含んでいます。またテトラサイクリン耐性遺伝子を運ぶRNアーゼIII遺伝子（dsRNAse）を欠損する）16 60ミリメートルペトリ皿 100ミリメートルペトリ皿 14ミリリットルの丸底ファルコン培養管 スライドガラス カバーガラス 1から20μlのピペッター 20から200μlのピペッター 200-1000μLピペッター 1から200μlのピペットチップ 200-1000μlのピペットチップ 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ 白金線ワームピック</td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

二本鎖RNA媒介干渉（RNAi）は1月3日 、標的遺伝子の発現をノックダウンする効果的な戦略である。それは植物、無脊椎動物と脊椎動物を含む多くのモデルシステムに適用されています。 生体 4,5 でRNAiを達成するためのさまざまな方法があります。一過性かもしれない代わりに特定の標的遺伝子（RNAiのオリゴ）から二本鎖オリゴヌクレオチドを​​合成し、例えば、標的遺伝子がRNAiのベクトルに変換することができ、その後永久に、または一過性に遺伝子ノックダウンの効果を達成するために、細胞株や初代培​​養細胞に形質転換標的遺伝子を沈黙させる細胞株や初代培​​養細胞に形質転換し、または合成さ​​れた二本鎖RNA分子が生体に微量注入することができる。線虫C.以来虫、細菌が標的遺伝子に対する二本鎖RNAを発現する動物の餌、食料源として細菌を使用して実行可能な戦略6を提供しています。ここではRNAiの給餌を提示体の大きさの表現型を獲得するための方法。 Cのボディサイズ虫は主に 、TGF-βによって調節されている-のような配位子DBL-1ので、このアッセイは、TGF-βシグナル伝達成分7の識別に適しています。私たちは、RNAi給餌実験を再現する2 RNAiの過敏株を含む様々な菌株を使用していました。我々の結果は、RRF-3株は私たちに最高の期待されるのRNAi表現型を与えることを示した。方法は、実施が容易で再現性があり、容易に定量化される。さらに、我々のプロトコルでは、特殊な装置の使用を最小限に抑えているので、小さな実験室や主に学部機関の人に適しています。

私たちの研究では、DBL-1/TGF-β経路による体の大きさの規制に重点を置いています。野生型動物7,10,11に比べ短いボディの長さも含めて、小さなボディサイズでDBL-1経路の結果、の機能の喪失。したがって、Cの画面虫の体の大きさの変異体は、TGF-βシグナル伝達成分と修飾子を識別することが可能である。 DBL-1シグナルが細胞表面の受容体と細胞内のSmadシグナルトランスデ...

Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

我々は、標的遺伝子とスコアボディサイズの表現型をノックダウンするのRNAi送り技法を使用する方法を示し<em&gt; Cエレガンス</em&gt;。このメソッドは、DBL-1/TGF-βシグナリングによるボディサイズ調節に関与するものなど興味のある潜在的な遺伝的要素を識別するために大規模なスクリーンを使用することができる。

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法<em&gt; C。エレガンス</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...