Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Vi takker James Clark for å gi tall av dyr på ulike utviklingsforstyrrelser tidspunkter. C. elegans stammer i denne studien er hentet fra Caenorhabditis Genetics Center, som er støttet av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dette arbeidet ble støttet av CIRG 1817 fra CUNY til JL og CSD, og ​​ved NIH 1R15GM073678-01 og 1R15GM097692-01 til CSD Vi takker Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman, og Melissa Silvestrini for kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble utført i delvis oppfyllelse av kravene til en doktorgrad fra Graduate Center of the City University of New York (S. Xiong).

1. Forbereder RNAi Feeding Plater Bære Target Gene Sequence <ol><li> Hvis du bruker kommersielt tilgjengelige RNAi bibliotekene (f.eks fra Source BioScience LifeSciences), går du til trinn 1.4. Alternativt klone target gensekvenser i L4440 vektor, en vanlig orm RNAi plasmid 8, etter standard kloning protokoll. </li><li> Transformere rekombinant plasmid inn bakteriestammen HT115 (DE3), kultur dem på LB agarplater med 25 ug / ml Carbenicillin og 12,5 ug / ml tetracyklin, og velge en enkelt klon fo...

<ol>
	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo.">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li><li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi.">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF&#946;+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans.">The expression of TGF&#946; signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling.">TGF-&#946; signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li><li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evo-devo:+variations+on+ancestral+themes.">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

I denne protokollen, beskriver vi vår metode for identifisering av kroppsstørrelse defekte mutanter av C. elegans av RNAi fôring. Denne metoden kan anvendes til identifisering av TGF-β signalveier komponenter. Siden slike komponenter er svært konservert gjennom evolusjonen 15, slike skjermer er relevante for å belyse de molekylære mekanismene for TGF-β signalering i alle metazoans. Et viktig hensyn i utformingen slik skjerm er utgangspunktet belastningen. Vi har vist at både Eri-1, lin-1...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi ormen plater 17,7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Legg H 2 O til 3 liter. Autoklaven. Tilsett 3 ml 1M IPTG (sterilt) og 3 ml 25 mg / ml Carbenicillin (sterilt), og hell i 60 mm petriskåler. Worm plater 17,7 g Worm Medium Mix 0,6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Legg H 2 O til 3 liter. Autoklaven. Hell over i 60 mm petriskåler. Worm Medium Mix 55 g tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg kolesterol 200 g NaCl Bland grundig og være sikker på å unngå biter; denne pulverisert blanding kan lagres i mange måneder før bruk. 2% agarose 0,5 g Agarose Annonsed 25 ml dH 2 O. Varme i mikrobølgeovn til det er oppløst. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Oppløse in10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN 3 Legg dH 2 O til 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Legg dH 2 O til 100 ml Caenorhabditis elegans fra Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (bærer ampicillin-resistens genet) Bakterier stamme HT115 (DE3) (inneholder IPTG induserbar T7 polymerase, mangelfull for RNase III genet (en dsRNAse) som også bærer tetracyklin-motstand genet) 16 60 mm petriskåler 100 mm petriskåler 14 ml rundbunnet Falcon kultur rør glassplater glass dekkglass 1-20 ul pipetten 20-200 ul pipetten 200-1000 ulpipetten 1-200 ul pipettespisser 200-1000 ul pipettespisser 1,5 ml Eppendorf-rør platinatråd orm pick </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Double-strand RNA-mediert interferens (RNAi) er en effektiv strategi for å slå ned målet genuttrykk 1-3. Det har blitt brukt til mange modell systemer, inkludert planter, dyr og virveldyr. Det finnes ulike metoder for å oppnå RNAi in vivo 4,5. For eksempel kan målgenet bli transformert til en RNAi vektor, og deretter enten permanent eller forbigående forvandlet til cellelinjer eller primære celler for å oppnå genet knockdown effekter, alternativt syntetisert dobbelt-strand oligonukleotider fra bestemte målgener (RNAi oligoer) kan være forbigående forvandlet til cellelinjer og primære celler for å slå målgener, eller syntetisert dobbel tråd RNA-molekyler kan microinjected i en organisme. Siden nematode C. elegans bruker bakterier som matkilde, mate dyr med bakterier uttrykker dobbel tråd RNA mot målgener gir en levedyktig strategi 6. Her presenterer vi en RNAi fôringmetode å score kroppsstørrelse fenotype. Kroppsstørrelse i C. elegans reguleres primært ved TGF-β - som ligand DBL-1, slik at denne analysen er hensiktsmessig for identifisering av TGF-β signalnettverk komponenter 7. Vi brukte forskjellige stammer inkludert to RNAi hypersensitive stammer å gjenta RNAi fôring eksperimenter. Våre resultater viste at RRF-3 belastning ga oss den beste forventede RNAi fenotype. Metoden er enkel å utføre, reproduserbar, og lett kvantifisert. Videre reduserer vår protokoll bruk av spesialisert utstyr, så det er egnet for mindre laboratorier eller de på hovedsakelig lavere institusjoner.

I vår forskning har vi fokus på kroppsstørrelse regulering av DBL-1/TGF-β veien. Tap av funksjon av DBL-1 bane resulterer i liten kroppsstørrelse, inkludert en kortere kroppslengde sammenlignet med vill-type dyr 7,10,11. Dermed skjermer for C. elegans kroppsstørrelse mutanter er i stand til å identifisere TGF-β signalering komponenter og modifikatorer. DBL-1 signalering er mediert av et konservert TGF-β signaltransduksjon sti som inkluderer celleoverflatereseptorer og intracellulære Smad si...

Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Vi viser hvordan du bruker RNAi fôring teknikk for å slå ned målgener og score kroppsstørrelse fenotype i<em&gt; C. elegans</em&gt;. Denne metoden kan brukes for et stort skala skjermen for å identifisere potensielle genetiske komponenter av interesse, slik som de som er involvert i kroppsstørrelse regulering gjennom DBL-1/TGF-β signalering.

Bruke RNA-mediert interferens fôringsstrategi til skjerm for gener involvert i Body Size forordning i nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarging i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Ved hjelp av &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Storskala Gene Knockdown i<em&gt; C. elegans</em&gt; Bruke dsrna Fôrings biblioteker for å generere en solid tap-av-funksjon Fenotyper

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder for å vurdere subcellulære avdelinger av muskel i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling glutation-indusert Fôring Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og Kvantifisering utviklingsprosesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Ved hjelp av Open-source verktøy

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Måling av RAN Peptid toksisitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...