Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Agradecemos James Clark para a prestação de figuras de animais em vários pontos de tempo de desenvolvimento. C. elegans estirpes neste estudo foram obtidos a partir do Centro de Genética Caenorhabditis, que é suportado pelo National Center for NIH Research Resources (NCRR). Este trabalho foi financiado pelo CIRG 1817 da CUNY a JL e CDS, e pelo NIH 1R15GM073678-01 e 1R15GM097692-01 a CSD Agradecemos ao Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman, e Melissa Silvestrini para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi realizado em cumprimento parcial das exigências para um grau de doutoramento do Centro de Pós-Graduação da Universidade da Cidade de Nova York (S. Xiong).

1. Preparando Placas de alimentação RNAi de transporte sequência do gene alvo <ol><li> Se o uso de bibliotecas disponíveis comercialmente RNAi (por exemplo, de LifeSciences Fonte BioScience), vá para o passo 1.4. Alternativamente, clonar seqüências de genes-alvo em vetor L4440, um worm comumente usado RNAi plasmídeo 8, por meio de protocolo de clonagem padrão. </li><li> Transformar o plasmídeo recombinante na estirpe bacteriana HT115 (DE3), a cultura deles em placas de agar LB com 25 ug /...

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	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. 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L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos o nosso método para a identificação de mutantes defeituosos o tamanho do corpo de C. elegans alimentação por RNAi. Este método é aplicável para a identificação dos componentes de sinalização de TGF-β. Uma vez que estes componentes são altamente conservadas através da evolução 15, tais telas são relevantes para elucidar os mecanismos moleculares de TGF-β sinalização em todos metazoários. Uma consideração importante na concepção de uma tal tela é ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Verme placas de RNAi 17,7 g Mix Médio Worm 60 g Agar Adicionar H 2 O a 3 litros. Autoclave. Adicionar 3 ml de 1M IPTG (estéril) e 3 ml de 25 mg / ml de carbenicilina (estéril), e depois verte-se sobre 60 placas de Petri milímetros. Placas de vermes 17,7 g Mix Médio Worm 0,6 g de sulfato de estreptomicina 60 g Agar Adicionar H 2 O a 3 litros. Autoclave. Despeje em 60 milímetros pratos de Petri. Mix Médio Worm 55 g de Tris-Cl 24 g de Tris-OH 310 g de Bacto Peptona 800 mg Colesterol 200 g de NaCl Misturar completamente e ter a certeza de evitar pedaços; esta mistura em pó pode ser armazenado durante muitos meses antes da utilização. 2% de agarose 0,5 g de agarose Anúnciod 25 ml dH 2 O. O calor no forno de microondas até dissolver. 1M isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 2 g IPTG Dissolver em10 mL de dH2O 1M NaN3 6,5 g de NaN3 Adicionar dH 2 O para 100 ml 25 mM de NaN3 2,5 ml de NaN3 1M Adicionar dH 2 O para 100 ml Caenorhabditis elegans de Caenorhabditis Genetics Centro L4440 plasmídeo (transporta resistência à ampicilina gene) Bactérias estirpe HT115 (DE3) (contém IPTG induzível da polimerase T7; deficiente para ARNase III gene (uma dsRNAse), que também transporta gene de resistência à tetraciclina) 16 60 milímetros placas de Petri 100 milímetros placas de Petri 14 ml de fundo redondo cultura tubos Falcon lâminas de vidro lamínulas 1-20 pipetador ul 20-200 pipetador ul 200-1000 ulpipetador 1-200 uL pontas de pipeta 200-1000 uL pontas de pipeta 1,5 ml tubos Eppendorf platina escolha verme fio </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Double-strand RNA de interferência mediada (RNAi) é uma estratégia eficaz para derrubar alvo de expressão gênica 1-3. Ele foi aplicado a muitos sistemas de modelos, incluindo plantas, invertebrados e vertebrados. Existem vários métodos para atingir RNAi in vivo 4,5. Por exemplo, o gene alvo pode ser transformado em um vetor de RNAi, e, em seguida, de forma permanente ou transitória transformado em linhas celulares ou células primárias para alcançar efeitos knockdown do gene, alternativamente sintetizados oligonucleótidos de cadeia dupla a partir de genes alvo específicos (RNAi oligos) pode ser transitoriamente transformadas em linhas celulares ou células primárias de silenciar genes alvo, ou sintetizados moléculas de ARN de cadeia dupla pode ser microinjectado num organismo. Uma vez que o nemátodo C. elegans usa bactérias como fonte de alimento, a alimentação dos animais com bactérias expressando RNA de cadeia dupla contra genes alvo proporciona uma estratégia viável 6. Aqui apresentamos uma alimentação RNAimétodo para marcar fenótipo tamanho do corpo. Tamanho do corpo em C. elegans é regulado principalmente pelo TGF-β - ligante como DBL-1, de modo que este ensaio é adequado para a identificação de TGF-β componentes de sinalização 7. Usamos diferentes cepas incluindo duas linhagens de RNAi hipersensíveis repetir os experimentos de alimentação de RNAi. Nossos resultados mostraram que RRF-3 tensão nos deu o melhor fenótipo RNAi esperado. O método é de fácil execução, reprodutível e facilmente quantificada. Além disso, o nosso protocolo minimiza o uso de equipamento especializado, pelo que é adequado para laboratórios menores ou aqueles em instituições predominantemente de graduação.

Em nossa pesquisa, focamos na regulação do tamanho corporal pela via DBL-1/TGF-β. A perda da função dos resultados DBL-1 via de tamanho pequeno corpo, incluindo um menor comprimento de corpo comparado com animais de tipo selvagem 7,10,11. Assim, telas para C. mutantes tamanho elegans do corpo são capazes de identificar os componentes de sinalização de TGF-β e modificadores. DBL-1 sinalização é mediada por uma via de transdução conservada TGF-β sinal que inclui os receptores da...

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Nós demonstramos como usar a técnica de alimentação RNAi para derrubar genes-alvo e pontuação fenótipo tamanho do corpo<em&gt; C. elegans</em&gt;. Este método poderia ser utilizado para um ecrã de grande escala para identificar potenciais componentes genéticos de interesse, tais como aqueles que estão envolvidos na regulação do tamanho do corpo por sinalização DBL-1/TGF-β.

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Biologia

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Em larga escala Knockdown Gene em<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

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Métodos para avaliar os compartimentos subcelulares do músculo em C. elegans.

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

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Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

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Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...