Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
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Damos las gracias a James Clark para proporcionar figuras de animales en diferentes puntos en el tiempo de desarrollo. C. elegans cepas en este estudio se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis, que es apoyado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). Este trabajo fue apoyado por CIRG 1817 de CUNY a JL y CSD, y por el NIH 1R15GM073678-01 y 1R15GM097692-01 a la CDS Agradecemos al Dr. William J Rice, el Dr. Nathalia Holtzman, y Silvestrini Melissa para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo se llevó a cabo en cumplimiento parcial de los requisitos para un doctorado en el Centro de Graduados de la City University de Nueva York (S. Xiong).

1. Preparación de las placas de RNAi de alimentación que llevan la secuencia del gen diana <ol><li> Si se utilizan las bibliotecas RNAi disponibles comercialmente (por ejemplo, de LifeSciences Fuente BioScience), vaya al paso 1.4. Alternativamente, clonar secuencias de genes diana en el vector L4440, un gusano utiliza comúnmente RNAi plásmido 8, por el protocolo de clonación. </li><li> Transformar el plásmido recombinante en la cepa bacteriana HT115 (DE3), cultivarlas en placas de agar LB con...

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	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. 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L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

En este protocolo, describimos nuestro método para la identificación de mutantes defectuosos tamaño corporal de C. elegans por alimentación RNAi. Este método es aplicable a la identificación de los componentes de señalización de TGF-β. Puesto que tales componentes están altamente conservadas a través de la evolución 15, tales pantallas son relevantes para elucidar los mecanismos moleculares de la señalización de TGF-β en todos los metazoos. Una consideración importante en el diseño d...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi placas gusano 17,7 g Gusano Media Mix 60 g Agar Añadir H 2 O a 3 litros. Autoclave. Añadir 3 ml de 1 M de IPTG (estéril) y 3 ml de 25 mg / ml de carbenicilina (estéril); después se vierte en 60 mm placas de Petri. Placas Gusano 17,7 g Gusano Media Mix 0,6 g de sulfato de estreptomicina 60 g Agar Añadir H 2 O a 3 litros. Autoclave. Vierta la mezcla en 60 mm placas de Petri. Gusano Mix Media 55 g de Tris-Cl 24 g de Tris-OH 310 g de Bacto peptona 800 mg Colesterol 200 g de NaCl Mezclar bien y asegúrese de evitar pedazos, lo mezcla en polvo puede ser almacenado durante muchos meses antes de su uso. 2% de agarosa 0,5 g de agarosa Anunciod 25 ml dH 2 O. Calentar en el microondas hasta que se disuelve. 1M isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 2 g IPTG Disolver in10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g de NaN3 Añadir dH 2 O y 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml de 1M NaN 3 Añadir dH 2 O y 100 ml Caenorhabditis elegans de Caenorhabditis Centro de Genética Plásmido L4440 (lleva resistencia a ampicilina gen) Las bacterias cepa HT115 (DE3) (contiene inducible por IPTG polimerasa T7; deficiente para la RNasa III gen (un dsRNAse) que también lleva el gen de resistencia a tetraciclina) 16 60 mm Placas de Petri 100 mm placas de Petri 14 ml de fondo redondo Falcon tubos de cultivo portaobjetos de vidrio cubreobjetos de vidrio 1-20 pipeta l 20-200 l pipeta 200-1000 lpipeta Puntas de pipeta 1-200 mu l 200-1000 puntas de pipeta mu l 1,5 ml tubos Eppendorf alambre de platino gusano selección </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Haga doble cadena de ARN mediada por interferencia (ARNi) es una estrategia efectiva para derribar objetivo de la expresión génica 1-3. Se ha aplicado a muchos sistemas modelo incluyendo plantas, invertebrados y vertebrados. Hay varios métodos para lograr la RNAi in vivo 4,5. Por ejemplo, el gen diana puede ser transformado en un vector de ARNi, y a continuación, ya sea permanentemente o transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias para lograr los efectos de genes desmontables; alternativamente sintetizarse oligonucleótidos de doble cadena a partir de genes diana específicos (RNAi oligos) puede ser transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias de silenciar genes diana, o sintetizado de doble filamento moléculas de ARN puede microinyectarse en un organismo. Desde el nematodo C. elegans utiliza bacterias como fuente de alimento, la alimentación de los animales con bacterias que expresan ARN de cadena doble contra genes diana proporciona una estrategia viable 6. A continuación les presentamos una alimentación RNAimétodo de anotar el tamaño del cuerpo fenotipo. Tamaño del cuerpo en C. elegans está regulada principalmente por el TGF-β - ligando como DBL-1, por lo que este método es apropiado para la identificación de TGF-β componentes de señalización 7. Utilizamos diferentes cepas incluyendo dos cepas RNAi hipersensibilidad a repetir los experimentos de alimentación RNAi. Nuestros resultados mostraron que la FRR-3 cepa nos dio el mejor esperada fenotipo RNAi. El método es fácil de realizar, reproducible, y se cuantifica fácilmente. Por otra parte, el protocolo minimiza el uso de equipo especializado, por lo que es adecuado para laboratorios pequeños o aquellos en instituciones predominantemente de licenciatura.

En nuestra investigación, nos centramos en el tamaño corporal regulación por la vía DBL-1/TGF-β. La pérdida de función de los resultados vía DBL-1 en el tamaño corporal pequeño, como una longitud de cuerpo más corto en comparación con el de tipo salvaje animales 7,10,11. Así, las pantallas de C. elegans mutantes tamaño del cuerpo son capaces de identificar TGF-β componentes de señalización y modificadores. DBL-1 de señalización está mediada por una conservadas TGF-β vía de trans...

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Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Se demuestra cómo utilizar la técnica de alimentación RNAi para derribar los genes diana y el fenotipo puntuación en el tamaño del cuerpo<em&gt; C. elegans</em&gt;. Este método podría ser utilizado para una pantalla de gran escala para identificar los posibles componentes genéticos de interés, tales como los implicados en la regulación del tamaño del cuerpo por la señalización de DBL-1/TGF-β.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Investigación

Biología

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Derribo Gene a gran escala en<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

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Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

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El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

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Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...