Name: using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Vi tackar James Clark för att ge siffror djur vid olika utvecklings tidpunkter. C. elegans stammar i denna studie erhölls från Caenorhabditis Genetics Center, som stöds av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Detta arbete stöddes av CIRG 1817 från CUNY till JL och CSD, samt NIH 1R15GM073678-01 och 1R15GM097692-01 till CSD Vi tackar Dr William J Rice, Dr Nathalia Holtzman, och Melissa Silvestrini för kommentarer på manuskriptet. Detta arbete utfördes i delvis uppfylla kraven för doktorsexamen från Graduate Center på City University i New York (S. Xiong).

1. Förbereda RNAi Feeding Plattor Redovisat Sequence målgen <ol><li> Om du använder kommersiellt tillgängliga RNAi-bibliotek (t.ex. från källan BioScience Lifesciences), fortsätt till steg 1,4. Alternativt klona målsekvenser gen i vektor L4440, ett vanligt mask RNAi plasmiden 8, genom vanlig kloning protokoll. </li><li> Omvandla den rekombinanta plasmiden i bakteriestammen HT115 (DE3), kultur dem på LB-agarplattor med 25 | ig / ml karbenicillin och 12,5 pg / ml tetracyklin, och plocka en e...

<ol>
	<li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals.">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li><li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA:+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy.">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li><li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+movement+in+plants.">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li><li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo.">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li><li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi.">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li><li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF&#946;+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans.">The expression of TGF&#946; signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling.">TGF-&#946; signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li><li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evo-devo:+variations+on+ancestral+themes.">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li></ol>

I detta protokoll beskriver vi vår metod för identifiering av defekta kroppsstorlek mutanter av C. elegans by RNAi utfodring. Denna metod är lämplig för identifikation av TGF-β signalering komponenter. Eftersom sådana komponenter är högkonserverade genom evolutionen 15, sådana skärmar är relevanta att belysa de molekylära mekanismerna av TGF-β signalering i alla metazoans. Ett viktigt övervägande vid utformningen av en sådan skärm är utgångspunkten stammen. Vi har visat att både ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi mask plattor 17,7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Lägg H 2 O till 3 liter. Autoklav. Tillsätt 3 ml 1 M IPTG (steril) och 3 ml 25 mg / ml karbenicillin (steril), häll sedan i 60 mm Petri-skålar. Worm plattor 17,7 g Worm Medium Mix 0,6 g streptomycinsulfat 60 g Agar Lägg H 2 O till 3 liter. Autoklav. Häll i 60 mm petriskålar. Worm Mellan Mix 55 g Tris-Cl 24 g tris-OH 310 g Bacto pepton 800 mg Kolesterol 200 g NaCl Blanda väl och se till att undvika bitar, vilket pulverblandning kan lagras i flera månader före användning. 2% agaros 0,5 g agaros Add 25 ml dH 2 O. Värm i mikrovågsugn tills upplöst. 1M Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) 2 g IPTG Lös IN10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaNs 3 Lägg dH 2 O till 100 ml 25 mM NaNj 3 2,5 ml 1 M NaNs 3 Lägg dH 2 O till 100 ml Caenorhabditis elegans från Caenorhabditis Genetics Center L4440-plasmid (bär ampicillin-resistensgen) Bakterier stam HT115 (DE3) (innehåller IPTG-inducerbar T7-polymeras, bristfällig för RNas III-gen (en dsRNAse) som också bär tetracyklin-resistensgen) 16 60 mm Petriskålar 100 mm Petriskålar 14 ml rundbottnad Falcon odlingsrör glasskivor täckglas 1-20 ul pipett 20-200 ul pipett 200-1000 ulpipett 1-200 il pipettspetsar 200-1000 il pipettspetsar 1,5 ml Eppendorf-rör platinatråd mask plocka </td></tr></tbody></table>

using rna-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode c. elegans

Dubbelsträngat RNA-medierad interferens (RNAi) är en effektiv strategi för att slå ner mål 1-3 genuttryck. Det har använts i många modellsystem, inklusive växter, ryggradslösa djur och ryggradsdjur. Det finns olika metoder för att uppnå RNAi in vivo 4,5. Till exempel kan målgenen omvandlas till en RNAi vektor, och sedan antingen permanent eller tillfälligt omvandlas till cellinjer eller primära celler för att uppnå effekter gen knockdown, alternativt syntetiserade dubbel tråd oligonukleotider från specifika målgener (RNAi oligos) kan tillfälligt omvandlas till cellinjer eller primära celler att tysta målgener, eller syntetiserade dubbelsträngade RNA-molekyler kan mikroinjiceras i en organism. Eftersom nematoden C. elegans använder bakterier som en näringskälla, utfodra djuren med bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA mot målgener ger en hållbar strategi 6. Här presenterar vi en RNAi utfodringmetod att göra mål fenotyp kroppsstorlek. Kroppsstorlek i C. elegans regleras primärt av TGF-β - liknande ligand DBL-1, så denna analys är lämplig för identifiering av TGF-β signalering komponenter 7. Vi använde olika stammar, inklusive två RNAi överkänsliga stammar att upprepa de RNAi utfodring experiment. Våra resultat visade att RRF-3-stammen gav oss den bästa förväntade RNAi fenotyp. Metoden är enkel att utföra, reproducerbar, och lätt kvantifieras. Dessutom minimerar vår protokoll att använda specialutrustning, så det är lämpligt för mindre laboratorier eller de vid övervägande grundutbildningen institutioner.

I vår forskning fokuserar vi på kroppsstorlek reglering av DBL-1/TGF-β vägen. Förlusten av funktionen hos de DBL-1 metabolismvägen leder små kroppsstorlek, inklusive en kortare kroppslängd jämfört med vildtyp djur 7,10,11. Således skärmar för C. elegans kroppsstorlek mutanter har förmåga att identifiera TGF-β signalering komponenter och modifierare. DBL-1 signalering medieras av en konserverad TGF-β signaltransduktionsväg som innefattar cellytreceptorer och intracellulära Smad giva...

Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans at JoVE.com

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Vi visar hur man använder RNAi utfodring teknik för att slå ner målgener och poäng kroppsstorlek fenotyp i<em&gt; C. elegans</em&gt;. Denna metod kan användas för en storskalig skärm för att identifiera potentiella genetiska komponenter av intresse, såsom de som är inblandade i kroppsstorlek reglering av DBL-1/TGF-β signalering.

Använda RNA-medierad strategi Interference Matning att screena för gener involverade i kroppsstorlek förordningen i rundmasken<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Storskalig Gene Knockdown i<em&gt; C. elegans</em&gt; Med hjälp av dsRNA Feeding bibliotek för att generera Robust förlust-av-funktion Fenotyper

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mätning Glutation-inducerad Foder Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Använda Open-source-verktyg

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...