Name: dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Мы любезно благодарит д-р Джон Хейс для скриптов; доктора. Эрик Брэдли и Кристофер Дель Негро за помощью конфокальной микроскопии; Дрю Хьюз, Лаура ODORIZZI, Алекс Garafalo, Ребекка Lowden, и Лиз MacMurray за их работу по разработке проекта и предоставления предварительным данным, д-р Грег Смит за полезные предложения по статистическому анализу. Эта работа была поддержана NIH грант (NINDS IR15N5067566-01) для ПСС и Медицинского института Говарда Хьюза Наука Образование грант в колледж Уильяма и Мэри.

Все эксперименты проводятся следующие протоколы утвержденные Институциональные уходу и использованию животных комитета в Колледже Уильяма и Мэри. Стадии развития, указанные в данном протоколе в соответствии с Nieuwkoop и Фабера 46. 1. Диссекция <ol><li> Разрешить среду к...

Благодаря хорошо изученных типов клеток, которые сохраняются во всех позвоночных животных, сетчатка представляет собой полезную модель для изучения молекулярно-клеточные процессы, определяющие ячейки спецификации типа и дифференциации. Первичные культуры клеток дает мощный метод и...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Для вскрытия и культивирование </td></tr><tr><td> BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Посуда, 35 мм </td><td> Рыбак </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> Одноразовые полистирола чашки Петри, 60 х 15 мм </td><td> Рыбак </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 мм Nunclon поверхности чашки Петри (с AIRVENT) </td><td> Рыбак </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Дюмон изобразительных щипцы (Dumostar # 55) </td><td> Рыбак </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-правили пластиковые покровное, 25 мм </td><td> Рыбак </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Этил-м-аминобензойной кислоты соль метансульфонат (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, ООО </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Гентамицина сульфат </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco трипсина (1:250) порошок </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Коллагеназа B с Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллина-стрептомицина </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Нил синий сульфат (опционально) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 мл вакуум-фильтра / хранения бутылок системы, поры 0,22 мкм 33,2 см 2 CN Мембрана </td><td> Гранулирование </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> Для кальция изображений </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 мМ раствор в ДМСО, сотовый Постоянного </td><td> Life Technologies </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 10% раствора в воде </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 конфокальной системы микроскопа </td><td> Zeiss </td><td> Модели снятые </td><td></td></tr><tr><td> Блокировка реагентов </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Для люминесцентных в гибридизация (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-дигоксигенин-POD, Fab фрагментов </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-HRP антител </td><td> Перкин-Элмер </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS эфир </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-Fluorescein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Формамид, деионизированной </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td> Torula РНК, типа IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Гепарин натриевая соль, из слизистой оболочки кишечника свиней </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 2. Специфических реагентов и оборудования. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Решение </td><td> Ссылка </td><td> Содержание </td></tr><tr><td> Средний культуре клеток </td><td> Чанг и Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 мм NaCl 0,67 мм KCl 2 мМ CaCl 2 1,31 мМ MgSO 4 4,6 мм Tris 1% (по объему) пенициллин / стрептомицин Отрегулируйте рН до 7,8 с помощью HCl. Фильтр стерилизуют, пропуская через 0,22 мкм фильтр CN. Хранить при температуре 4 ° C. </td></tr><tr><td> Кальций-Магний Бесплатные Средний (CMF) </td><td> Gu и др., 1994 42;. Гу и Spitzer, 1995 г. 55 </td><td> 116 мм NaCl 0,67 мм KCl 4,6 мм Tris 0,4 мМ EDTA 1% (по объему) пенициллин / стрептомицин Отрегулируйте рН до 7,8 с помощью HCl. Фильтр стерилизуют, пропуская через 0,22 мкм фильтр CN. Хранить при температуре 4 ° C. </td></tr><tr><td> Малеиновый буфера кислота (МАБ) </td><td> Sive и соавт., 2000 53 </td><td> 100 мМ малеиновой кислоты 150 мМ NaCl (рН 7,5). </td></tr><tr><td> Марка изменения Ringers (MMR), 10X </td><td> Sive и соавт., 2000 53 </td><td> 100 мМ NaCl мМ KCl 1 мМ MgSO 4 2 мМ CaCl 2 5 мМ HEPES рН доводят до 7,4 с помощью NaOH 0,1 X MMR также содержит 50 мг / мл гентамицина сульфата и рН доводят до 7,4 с помощью NaOH. </td></tr><tr><td> MEMFA решение, 10X </td><td> Sive и соавт., 2000 53 </td><td> 0,1 М MOPS (рН 7,4) 2 мМ EGTA 1 мМ MgSO 4 3,7% формальдегида 10X решение, без формальдегида, можно хранить при 4 ° C. Формальдегид добавляют свежую (1/10 объема стандартных 37% акций). </td></tr><tr><td> На месте буфера гибридизации </td><td> Sivэлектронной и соавт., 2000 53 </td><td> 50% формамид 5X SSC 1 мг / мл РНК Torula 100 мг / мл гепарина 1X Denhart в решение 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 мМ EDTA. </td></tr></tbody></table> Решения. * Гентамицин, антибиотик, используется в наших решениях MMR в то время как пенициллин и стрептомицин используются в наших средствах массовой информации культуре. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Процесс, при котором передней части нервной пластинки приводит к сетчатке позвоночных продолжает оставаться одним из основных направлений клинических и фундаментальных исследований. В дополнение к очевидной медицинской значение для понимания и лечения заболевания сетчатки, развитие позвоночных сетчатки продолжает служить важным и элегантная модель системы для понимания нейронных определения типа и дифференцировки клеток 1-16. Нейронных сетчатка состоит из шести отдельных типов клеток (ганглии, амакринные, горизонтальные, фоторецепторы, биполярные клетки, а клетки глии Мюллера), расположенных в стереотипных слои, шаблон, который в значительной степени сохраняется среди всех позвоночных 12,14-18. При изучении сетчатки в неповрежденной развивающегося эмбриона явно необходимы для понимания того, как это сложный орган развивается из выпячивания мозга в слоистую структуру, есть много вопросов, которые приносят сюдам применения подходов с использованием первичной культуры клеток предполагаемого клеток сетчатки 7,19-23. Например, анализ клеток из тканей удаляется и диссоциированных на различных этапах позволяет выявить состояние спецификация отдельных клеток на разных стадиях развития, то есть, судьба клеток в отсутствие взаимодействия с соседними тканями 8,19-22 ,24-33. Первичные культуры клеток также позволяет следователю относиться к культуре специфических реагентов и анализировать результаты на одном уровне клетки 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus Хепориз, классическая модель системы для изучения раннего развития нервной 19,27,29,31-32,40-42, служит особенно подходящей системой для сетчатки первичной культуре клеток 10,38,43-45. Фиксированные ткани сетчатки доступна с самых ранних стадиях развития, сразу после нейронной индукции 25,38,43. Кроме того, учитывая йв каждой ячейке в эмбрион содержит поставку желток, клетки сетчатки можно культивировать в очень простой определены сред, состоящих из буферного солевого раствора, удаляя при этом смешанное воздействие инкубации сыворотки или других продуктов на основе 10,24,44-45 . Тем не менее, изоляция ткани сетчатки от окружающих тканей и последующая обработка является сложной задачей. Здесь мы представляем метод для вскрытия и диссоциации клеток сетчатки в Xenopus Хепориз, который будет использоваться для подготовки первичных культур клеток, что, в свою очередь, быть проанализированы на активность кальция и экспрессии генов при разрешении отдельных клеток. В то время как темы, представленные в этой работе является анализ спонтанной переходных кальция, техника широко применима к широкому кругу вопросов исследования и подходы (рис. 1).

Примеры успешного расчлененный глазные пузыри (этап 25) и сетчатки (этап 35), показаны на рисунках 2E и 2J. Хотя этот протокол может быть использован на различных этапах развития, очень важно получить только ткани сетчатки, чтобы обеспечить точность для дальнейших экспери?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus Хепориз обеспечивает идеальную модельную систему для изучения клетки спецификации судьбы и физиологические функции отдельных клеток сетчатки в первичной культуре клеток. Здесь мы представляем технику для рассечения тканей сетчатки и формирования первичных культур клеток, что загружаются кальция деятельности и проанализированы в гибридизация.

Dissection, культуры и анализ<em&gt; Xenopus Хепориз</em&gt; Эмбриональные ткани сетчатки

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Препарирование Мышь Око за полного горе пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Лектин изоляции, основанные на культуре и мышь мотонейронов Эмбриональные

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Нейронных культур эксплантов от<em&gt; Xenopus Хепориз</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Простой Поведенческая Анализ для тестирования зрительной функции в<em&gt; Xenopus Laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Запись температурное нейронную активность посредством мониторинга изменений кальция в обонятельной луковицы<em&gt; Xenopus Laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...