Name: analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00
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Ce travail est soutenu par des fonds de démarrage de l&#39;Université de Louisville et CA135123 du National Institutes of Health (au CH).

1. Culture cellulaire et transfection <ol><li> Cellules COS-7 sont cultivées dans du milieu de Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplémenté avec 4,5 g / l de glucose et 10% de sérum fœtal bovin (FBS). </li><li> Transfection de plasmide est fait avec la Lipofectamine conformément aux instructions du fabricant (Invitrogen). </li></ol> 2. Fluorescence Analyse microscopique d&#39;expression à la surface cellulaire SNARE <ol><li> Le jour avant la transfection, 3 × 10 4 cellules CO...

<ol>
	<li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+protein+transport.">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li><li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion.">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion.">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs--engines+for+membrane+fusion.">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li><li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREpins:+minimal+machinery+for+membrane+fusion.">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li><li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li><li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs.">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li><li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+(VAMPs)+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception.">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238 (2010).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes.">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li><li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+[see+comments.">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li><li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobrevin,+a+novel+synaptobrevin/VAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome.">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li></ol>

Le dosage de la fusion cellulaire d&#39;origine 6 détermine SNARE médiation événements de fusion de cellules par microscopie à fluorescence. Nous décrivons ici un test innovant qui permet de quantifier SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l&#39;expression de la β-galactosidase et la mesure spectrométrique. En utilisant ce test, nous avons l&#39;habitude d&#39;analyser 15 à 20 V et t-SNARE combinaisons en une seule expérience. En utilisant la cytométrie en flux pour ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif et le matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> Cellules COS-7 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> pBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamine </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Sans enzyme solution de dissociation cellulaire </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Lapin anti-répresseur tet anticorps polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> Conjuguée au FITC âne anti-IgG (H + L) </td><td> JacImmunoResearch KSON </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Microscope à balayage laser confocal </td><td> Olympe </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux FACSCalibur </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-galactosidase système de dosage enzymatique avec un tampon de lyse Reporter </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Modèle 100-40 spectrophotomètre UV-VIS </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay

Les interactions des SNARE (s oluble N-éthylmaléimide facteur sensible à un ceptor re IÈCE JOINTE protéines) sur les protéines des vésicules (v-SNARE) et sur ​​les membranes cibles (t-SNARE) catalyser la fusion des vésicules intracellulaires 1-4. Essais de reconstitution sont essentiels pour disséquer le mécanisme et la régulation de la fusion membranaire médiée SNARE 5. Dans un dosage de 6,7 fusion cellulaire, les protéines sont exprimées SNARE ectopique à la surface cellulaire. Ces &quot;retourné&quot; SNARE entraînement protéines de fusion cellule-cellule, ce qui démontre que SNAREs sont suffisantes pour faire fondre les membranes cellulaires. Parce que le dosage de la fusion cellulaire est basée sur l&#39;analyse microscopique, il est moins efficace lorsqu&#39;il est utilisé pour analyser les multiples v-et t-SNARE interactions quantitativement. Nous décrivons ici un nouveau dosage 8 qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l&#39;expression de la β-galactosidase. Deuxles composants du système Tet-Off expression génique 9 sont utilisées comme un système de lecture: le transactivateur de tétracycline-commandé (tTA) et un plasmide rapporteur qui code pour le gène LacZ sous le contrôle de l&#39;élément de réponse à la tétracycline (TRE-LacZ). Nous transfecter tTA en cellules COS-7 exprimant v-SNARE retournées protéines à la surface cellulaire des cellules (v) et transfecter TRE-LacZ dans les cellules COS-7 exprimant retournées t-SNARE protéines à la surface cellulaire (cellules T) . SNARE dépendant de la fusion des v-et t-cellules entraîne la liaison de tTA au TRE, l&#39;activation de la transcription de LacZ et d&#39;expression de la β-galactosidase. L&#39;activité de la β-galactosidase est quantifié en utilisant une méthode colorimétrique par absorbance à 420 nm. Les protéines de la membrane des vésicules associées (Vamps) sont v-SNARE qui résident dans différents post-Golgi compartiments vésiculaires 10-15. En exprimant Vamps 1, 3, 4, 5, 7 et 8 du même niveau, on compare leur fusion membranaireactivités à l&#39;aide du dosage enzymatique cellule de fusion. Basé sur la mesure spectrométrique, cet essai propose une approche quantitative pour l&#39;analyse de la fusion membranaire médiée SNARE et à haut débit études.

De développer un test cellulaire quantitative de fusion, nous profitons de l&#39;activation transcriptionnelle forte par la liaison de tTA au TRE. En l&#39;absence de tTA, la transcription du gène LacZ dans TRE-LacZ est silencieux. Lorsque tTA est présent, il se lie à la TRE et active la transcription de LacZ. La figure 1 montre un organigramme du test de fusion cellulaire enzymatique. tTA est transfecté dans v-cellules qui expriment v-SNARE protéines à la surface cellu...

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Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Nous avons développé un test de fusion cellulaire qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion membranaire activé par l&#39;expression de la β-galactosidase.

Analyse de la fusion membranaire médiée SNARE en utilisant un dosage enzymatique cellulaire Fusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

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JoVE Journal

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