Name: mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Wir möchten Dr. Evan Newell und Dr. Sean Bendall für Rückfragen danken. Wir möchten auch DVS Sciences und Dr. Sean Bendall für eine Probe der Multi-Lanthanoid-Polystyrol-Kügelchen danken. Wir sind dankbar für die Finanzierung von NIH 2 U19 AI057229.

Alle Zellproben für die CyTOF müssen fixiert und permeabilisiert werden. Dies ermöglicht eine größere Eintrag des Iridium-haltigen DNA-Interkalator, und verhindert auch, dass während der Zelllyse MilliQ Wasser waschen und Resuspension Schritte unmittelbar vor der Injektion in die Masse Cytometer. Ein. Start-up der Messe Cytometer <ol><li> Öffnen Sie die CyTOF Software-Programm. Wählen Sie Instrument Setup. Auf der Karte Cage Registerkarte in der rechten unteren Ecke und klicken Sie...

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

In den letzten Jahrzehnten hat sich Fluoreszenz-Durchflusszytometrie war ein Arbeitstier Verfahren zur Analyse von einzelnen Zellen, sowohl in Bezug auf Oberflächen-Expression und funktionelle Assays. Allerdings hat die Fragen der spektralen Überlappung der Fluoreszenzfarbstoffe die Anzahl der gleichzeitigen Marker begrenzt. Während Experimente mit mehr als 12 gleichzeitige Marker gemeldet wurden, macht die Höhe der Entschädigung notwendigen dies technisch schwierig. Statt Fluorophore, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> CyTOF TM Masse Zytometer </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waschlösung </td><td> DVS Sciences </td><td> 201071 </td><td> 0,05% Flusssäure in Wasser </td></tr><tr><td> Tuning-Lösung </td><td> DVS Sciences </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, Spurenelemente Salpetersäure </td></tr><tr><td> Eu-haltigen Polystyrol-Kügelchen </td><td> DVS Sciences </td><td> 201073 </td><td> Enthält natürliche Überfluß Eu Isotopen; Perlen an rund 1 Mio. / ml geliefert </td></tr><tr><td> Multi-Lanthanoid-(La / Pr / Tb / Tm / Lu) - Polystyrol-Kügelchen </td><td> DVS Sciences </td><td> Noch nicht im Handel erhältlichen </td><td> Enthält natürliche Überfluß Isotope von börsennotierten Lanthaniden </td></tr><tr><td> Salpetersäure (konzentriert) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima Spur-Metall reinen ICP-MS Grade </td></tr><tr><td> Polystyrol mit rundem Boden Rohr mit Zell-Sieb cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> verwendet werden, um Zellproben vor der Injektion filtern </td></tr><tr><td> Norm-Ject Tuberkulin Spritze 1ml </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010-200V0 </td><td> silikonfrei, latexfrei </td></tr><tr><td> Norm-Ject Spritze-3 mL </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010.000V0 </td><td> silikonfrei, latexfrei </td></tr><tr><td> MilliQ Wasser </td><td></td><td></td><td> 18 M reines Wasser, darf nicht in Glas-oder Plastikflaschen, die mit handelsüblichen Waschmittel (wegen ihrer hohen Barium-present) gewaschen wurden gespeichert werden. </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> saures Reinigungsmittel </td></tr><tr><td> Argon-Gas </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% Ultra-hohe Reinheit </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

In den letzten Jahren hat die schnelle Analyse von Einzelzellen üblicherweise durchgeführt mittels Durchflusszytometrie und fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Allerdings ist das Problem der spektralen Überlappung von Fluorophor-Emissionen die Anzahl der gleichzeitigen Sonden begrenzt. Dagegen ist die neue Masse CyTOF Zytometer von DVS Sciences Paare eine Flüssigkeit einzellige Einführungssystem mit einem ICP-MS. 1 Anstatt Fluorophore werden chelatisierende Polymere enthaltenden hoch angereicherten Metall-Isotope an Antikörper oder andere spezifische Sonden gekoppelt. 2-5 Aufgrund der Metall-Reinheit und Massenauflösung der Masse Zytometer, gibt es keine &quot;spektrale Überlappung&quot; von benachbarten Isotope, und daher keine Notwendigkeit zur Kompensation Matrizen. Zusätzlich, aufgrund der Verwendung von Lanthanidmetallen, gibt es keine biologischen Hintergrund und damit kein Äquivalent Autofluoreszenz. Mit einer Masse Fenster Spanning Atommasse 103-203, theoretisch bis zu 100 Etiketten könnten gleichzeitig unterschieden werden. Gegenwärtig, Mehr als 35 Kanäle zur Verfügung mit dem Chelatisierungsreagenzien ab DVS Sciences, ermöglicht beispiellose Dissektion der immunologische Profil der Proben. 6-7 Nachteile sind die Masse Zytometrie strengen Notwendigkeit eines gesonderten Metallisotops pro Sonde (kein Äquivalent vorwärts oder side scatter), und die Tatsache, dass es ein zerstörungsfreies Verfahren (keine Möglichkeit der Sortierung Rückgewinnung) ist. Die aktuelle Konfiguration der Masse Zytometer hat auch eine Zellen-Übertragungsrate von nur ca. 25% und erfordern somit eine höhere Anzahl von Zellen-Eingang. Optimale tägliche Leistung der Masse Zytometer erfordert mehrere Schritte. Das grundlegende Ziel der Optimierung besteht darin, die gemessene Signalintensität der gewünschten Metall-Isotope (M) maximieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Bildung von Oxiden (M 16), daß das M Signalintensität zu verringern und stören beliebiger Signal an M +16. Der erste Schritt ist, um sich aufzuwärmen das Gerät so ein heißer, stabile ICP Plasma hergestellt wurde. Zweitens müssen die Einstellungen für aktuelle und Make-up-Gas-Strömungsrate auf einer täglichen Basis optimiert werden. Während der Probenahme wird der maximale Zelle Ereignisrate von Detektor-Effizienz und die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu 1000 Zellen / Sekunde begrenzt. Jedoch in Abhängigkeit von der Probe Qualität, eine langsamere Zelle Ereignisrate (300-500 Zellen / Sekunde) ist in der Regel wünschenswert, damit eine bessere Auflösung zwischen Zellen Ereignisse zu maximieren und somit intaktes Singuletts über Dubletts und Schutt. Schließlich trägt angemessene Reinigung der Maschine am Ende des Tages minimieren Hintergrundsignal durch freie Metall.

Nach dem obigen Protokoll sollte durchzuführen vier Dinge. Erstens wird damit ausreichende Aufwärmzeit für die Masse Zytometer erzeugen einen heißen, stabiles Plasma für optimales Signal und minimalen Oxidbildung. Zweitens ausreichendes Waschen der Masse Zytometer mit MilliQ Wasser und DVS Waschlösung (Abbildung 9) wird dazu beitragen, die Niveaus von Metall Adsorption an die Schläuche und andere Teile der Maschine und hilft, Hintergrund während Probenaufnahme reduzieren (Abb. 8).</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Die Schritte, die zur täglichen Abstimmung und Optimierung der Leistung einer CyTOF Masse Zytometer beschrieben. Kommentare zu optimalen Probenaufbereitung und Durchfluss werden diskutiert

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Forschung

Biotechnik

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Ein Protokoll für Bioinspirierte Entwurf: Ein Boden Sampler Basierend auf Seeigel Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...