Name: mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00
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Nos gustaría dar las gracias al Dr. Evan Newell y el Dr. Sean Bendall para la retroalimentación. También nos gustaría dar las gracias Ciencias DVS y el Dr. Sean Bendall para una muestra de las perlas de poliestireno múltiples que contienen lantánidos. Estamos muy agradecidos por la financiación de los NIH subvención AI057229 U19 2.

Todas las muestras de células para la CyTOF debe ser fijada y permeabilizada. Esto permite una mayor entrada de la intercalador de ADN que contiene iridio, y también previene la lisis celular durante el lavado con agua MilliQ y resuspensión inmediatamente antes de la inyección en el citómetro de masa. 1. Puesta en marcha del citómetro de masas <ol><li> Abra el programa CyTOF. Seleccione Configuración del instrumento. En la ficha canastilla para tarjetas, vaya a la esquina inferior d...

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Para las últimas décadas, la citometría de flujo de fluorescencia ha sido un método caballo de trabajo para el análisis de células individuales, tanto en términos de expresión en la superficie y en ensayos funcionales. Sin embargo, los problemas de la superposición espectral de los colorantes fluorescentes se ha limitado el número de marcadores simultáneas. Mientras que los experimentos que utilizan más de 12 marcadores simultáneos se ha informado, el monto de la compensación necesaria que hace que este t?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CyTOF TM masa citómetro </td><td> DVS Ciencias </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución de lavado </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201071 </td><td> 0,05% de ácido fluorhídrico en agua </td></tr><tr><td> Ajuste solución </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, ácido nítrico rastro </td></tr><tr><td> Eu que contienen perlas de poliestireno </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201073 </td><td> Contiene los isótopos naturales de abundancia de la UE; granos suministrados a aproximadamente 1 millón / mL </td></tr><tr><td> Múltiples que contienen lantánidos (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - perlas de poliestireno </td><td> DVS Ciencias </td><td> Todavía no disponible en el mercado </td><td> Contiene abundancia natural de isótopos de lantánidos cotizadas </td></tr><tr><td> Ácido nítrico (concentrado) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima rastro de metal puro ICP-MS grado </td></tr><tr><td> El poliestireno de fondo redondo de tubo con células colador cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> utiliza para filtrar las muestras de células antes de la inyección </td></tr><tr><td> Norma-Ject tuberkulin jeringa 1 ml </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010-200V0 </td><td> sin silicona, libre de látex </td></tr><tr><td> Norma-Ject-3 ml jeringa </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010.000V0 </td><td> sin silicona, libre de látex </td></tr><tr><td> MilliQ agua </td><td></td><td></td><td> 18 mW agua pura; no debe ser almacenado en botellas de vidrio o plástico que han sido lavadas con detergente comercial (debido a sus altos niveles de bario presente). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> ácido detergente </td></tr><tr><td> Gas argón </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% de pureza ultra alta </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

En los últimos años, el rápido análisis de células individuales que comúnmente se ha realizado usando citometría de flujo y anticuerpos marcadas con fluorescencia. Sin embargo, la cuestión de la superposición espectral de emisión de fluoróforo ha limitado el número de sondas simultáneamente. En contraste, el nuevo citómetro CyTOF masa por DVS pareja Ciencias un líquido único sistema de células de introducción a una ICP-MS. 1 En lugar de fluoróforos, polímeros quelantes que contienen altamente enriquecido isótopos metálicos están acopladas a anticuerpos u otras sondas específicas. 2-5 Debido a la pureza del metal y resolución de masa del citómetro de masa, no hay &quot;superposición espectral&quot; de isótopos vecinos, y por lo tanto no hay necesidad de matrices de compensación. Además, debido a la utilización de metales lantánidos, no hay fondo biológica y por lo tanto no equivalente de la autofluorescencia. Con una ventana de masa que abarca masa atómica 103-203, teóricamente hasta 100 etiquetas se podía distinguir simultáneamente. Actualmente, Más de 35 canales disponibles utilizando los reactivos quelantes disponible en Ciencias de la DVS, lo que permite una disección sin precedentes del perfil inmunológico de las muestras. 6-7 Las desventajas de la citometría de masa incluyen el requisito estricto de un isótopo de metal separado por sonda (no equivalente de dispersión frontal o lateral), y el hecho de que es una técnica destructiva (sin posibilidad de ordenar la recuperación). La configuración actual del citómetro de masa también tiene una velocidad de transmisión de células de sólo ~ 25%, por lo que requieren un número de entrada más alta de células. Óptimo rendimiento diario del citómetro de masas requiere varios pasos. El objetivo básico de la optimización es maximizar la intensidad de señal medida de los isótopos metálicos deseados (M) mientras se minimiza la formación de óxidos (M +16) que disminuirá la intensidad de la señal M e interferir con cualquier señal deseada a M +16. El primer paso es para calentar la máquina para un caliente, estable ICP plasma ha sido establecida. En segundo lugar, los ajustes para la velocidad de flujo de gas actual y el maquillaje debe ser optimizado en una base diaria. Durante la recogida de la muestra, la velocidad de células de evento máxima está limitada por la eficiencia del detector y la velocidad de procesamiento a 1000 células / segundo. Sin embargo, dependiendo de la calidad de la muestra, un tipo de célula caso, más lento (300-500 células / segundo) es por lo general deseable para permitir una mejor resolución entre los eventos de las células y por lo tanto maximizar singletes intactas sobre dobletes y escombros. Por último, la adecuada limpieza de la máquina al final del día ayuda a minimizar la señal de fondo debido a metal libre.

Siguiendo el protocolo anterior debe lograr cuatro cosas. En primer lugar, lo que permite suficiente tiempo de calentamiento para el citómetro de masas producirá un plasma caliente, estable necesaria para la formación óptima de la señal y óxido mínima. Segundo lavado adecuado del citómetro de masa con agua MilliQ y la solución de lavado DVS (Figura 9) ayudará a reducir los niveles de adsorción de metal a los tubos y otras partes de la máquina, lo que ayuda a reducir el fondo durante la adqui...

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Las medidas necesarias para la sintonización diaria y la optimización del rendimiento de un citómetro de masa CyTOF se describen. Comentarios sobre la preparación de la muestra y el caudal óptimo se discuten

Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

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