Name: mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Vi vill tacka Dr Evan Newell och Dr Sean Bendall för feedback. Vi vill också tacka DVS vetenskaper och Dr Sean Bendall för ett urval av de flera lantanid-innehållande polystyrenkulor. Vi är tacksamma för finansiering från NIH bidrag 2 U19 AI057229.

Alla cellprover för CyTOF måste fastställas och permeabiliserades. Detta möjliggör större inträde av iridium-innehållande DNA-interkalator, och förhindrar även cellys under MilliQ vattentvätt och steg resuspension omedelbart före injektionen in i massan cytometern. 1. Uppstart av mässan Cytometer <ol><li> Öppna CyTOF programmet. Välj Instrument Setup. På kort Cage fliken, gå till det nedre högra hörnet och klicka Värmare &quot;ON&quot;-knappen. Slå på värmaren minst ...

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Under de senaste årtiondena har fluorescens flödescytometri varit en arbetshäst metod för att analysera enskilda celler, både i fråga om yta uttryck och i funktionella analyser. Emellertid har frågan om spektral överlappning av de fluorescerande färgämnena begränsat antalet samtidiga markörer. Medan försök med mer än 12 samtidiga markörer har rapporterats, gör ersättningsbeloppet nödvändigt detta tekniskt svårt. Istället för fluoroforer, banade massa cytometri av DVS S...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CyTOF TM massa cytometer </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tvätta lösning </td><td> DVS Sciences </td><td> 201.071 </td><td> 0,05% fluorvätesyra i vatten </td></tr><tr><td> Tuning lösning </td><td> DVS Sciences </td><td> 201.072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, spår salpetersyra </td></tr><tr><td> Eu-innehållande polystyrenkulor </td><td> DVS Sciences </td><td> 201.073 </td><td> Innehåller naturligt överflöd Eu isotoper, pärlor tillhandahållas på cirka 1 miljon / ml </td></tr><tr><td> Multi-lantanid-innehållande (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polystyrenpärlor </td><td> DVS Sciences </td><td> Ännu kommersiellt tillgänglig </td><td> Innehåller naturligt överflöd isotoper av börsnoterade lantanider </td></tr><tr><td> Salpetersyra (koncentrerad) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima spår-metall ren ICP-MS kvalitet </td></tr><tr><td> Polystyren rundbottnad rör med cell-sil lock-5 ml </td><td> BD </td><td> 352.235 </td><td> används för att filtrera cellprover före injektion </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin spruta-1 ml </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010-200V0 </td><td> silikonfri, latexfri </td></tr><tr><td> Norm-Ject spruta-3 ml </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010.000V0 </td><td> silikonfri, latexfri </td></tr><tr><td> MilliQ vatten </td><td></td><td></td><td> 18 Mohm rent vatten, får inte förvaras i glas-eller plastflaskor som har tvättats med kommersiell rengöringsmedel (på grund av deras höga barium närvarande). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> surt rengöringsmedel </td></tr><tr><td> Argongas </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% ultrahög renhet </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

Under senare år har den snabba analysen av enstaka celler vanligen utförts med användning av flödescytometri och fluorescensmärkta antikroppar. Emellertid, har frågan om spektral överlappning av fluorofor utsläpp begränsade antalet samtidiga sönder. I motsats, den nya CyTOF massan cytometer av DVS Sciences kopplar en flytande enkel-cell-introduktion systemet till en ICP-MS. 1 stället fluoroforer är kelatbildande polymerer innehållande högt anrikade metall isotoper kopplade till antikroppar eller andra specifika sönder. 2-5 På grund av metall renhet och massa upplösning av massan cytometern, det finns ingen &quot;spektral överlappning&quot; från närliggande isotoper och därför inget behov av ersättning matriser. Dessutom, på grund av användningen av lantanid metaller, finns det inga biologiska bakgrund och därför ingen ekvivalent autofluorescens. Med en massa fönster spänner atommassa 103-203, teoretiskt upp till 100 etiketter kan urskiljas samtidigt. För närvarande, Mer än 35 kanaler är tillgängliga med hjälp av kelatbildande reagenser tillgängliga från DVS Sciences och möjliggjort en oöverträffad dissektion av det immunologiska profil prover. 6-7 Nackdelar med massa cytometri inkluderar strikta krav på en separat metall isotop per prob (ingen motsvarande framåt eller sidospridning), och det faktum att det är en destruktiv teknik (ingen möjlighet att sortera återvinning). Den nuvarande utformningen av massan cytometern har också en hastighet cell överföring av endast ~ 25%, vilket kräver en högre ingång antal celler. Optimala dagliga prestanda massan cytometern kräver flera steg. Det grundläggande målet för optimeringen är att maximera den uppmätta signalintensiteten av den önskade metallen isotoper (M) under minimering av bildningen av oxider (M +16) som kommer att minska M signalintensitet och störa någon önskade signalen vid M +16. Det första steget är att värma upp maskinen så en varm, stabil jagCP plasma har fastställts. Andra måste inställningarna för ström och smink gasflödeshastigheten optimeras på en daglig basis. Under provtagning, den maximala cellen händelsen ränta begränsas av detektor effektivitet och processorhastighet till 1000 celler / sekund. Beroende på provet kvalitet, en långsammare cell händelse takt (300-500 celler / sekund) är vanligtvis önskvärt att bättre upplösning mellan celler händelser och därmed maximera intakta undertröjor över dubbletter och skräp. Slutligen bidrar adekvat rengöring av maskinen vid slutet av dagen minimera bakgrunden signal på grund av fri metall.

Efter ovanstående protokoll bör utföra fyra saker. Först kommer tillåta tillräcklig uppvärmningstid för massan cytometern producera en varm, stabil plasma är nödvändig för optimal signal och minimal oxidbildning. Andra, tillfredsställande tvätt av massan cytometern med MilliQ vatten och DVS tvättlösning (figur 9) kommer att bidra till att minska halterna av metall adsorption till slangen och andra delar av maskinen, vilket bidrar till att minska bakgrunden under prov förvärv (F...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

De åtgärder som krävs för daglig avstämning och optimering av prestanda för en CyTOF massa flödescytometer beskrivs. Kommentarer till optimal provberedning och flöde diskuteras

Mass Cytometry: Protokoll för Daily Tuning och kör prover cell på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Kännetecknar Bakteriell Flyktiga använda Sekundär elektrospray Spectrometry jonisation (Sesi-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Extraction för riktade Stabil isotoputspädning Vätskekromatografi-masspektrometri Analys

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-området fluorescensmikroskopi och fluorescerande Imaging flödescytometri på en mobiltelefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Avbildning av biologiska vävnader genom desorption elektrospray masspektrometri

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Mönstring på fotolitografiskt Defined Parylen-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrat

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Provberedning Strategier för masspektrometri avbildning av 3D cellodlingsmodeller

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering av primära humana kolontumörceller från kirurgiska vävnader och Odling dem direkt på mjuka elastiska substrat för Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Ett protokoll för Bioinspired Design: En jord Sampler Baserat på Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Hela kroppen masspektrometri Imaging av Infrared Matrix-assisterad laserdesorption elektrosprayjonisering (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...