Name: high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA at JoVE.com

1. MEA Forberedelse <ol><li> MEAs for bruk i electroporation eksperimenter kan enten være fabrikkert ved hjelp av standard fotolitografi teknikk som beskrevet tidligere 18 eller kjøpes direkte fra leverandørene av MEA produsenter som flerkanals Systems <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> og Alpha MED Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Den MEAs brukes i våre eksperimenter ble fabr...

<ol>
	<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems.">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).</li><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550 (2002).</li><li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells.">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo.">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).</li><li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).</li><li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ,+on+a+partly+conductive+slide.">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li><li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers.">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes.">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+(ethyleneimine)+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium?+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer.">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells.">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture.">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+(MEA)+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording.">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li><li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays.">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li><li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery.">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li><li>Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+high-throughput+electroporation+chips.">Efficient and high-throughput electroporation chips.</a> , (2011).</li><li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays.">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo.">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region.">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

I denne videoen artikkelen viser vi bruken av MEA for stedsspesifikk transfeksjon av HeLa celler med kryptert sekvens av siRNA. En av fordelene med denne teknologien er dens anvendbarhet til forskjellige cellelinjer inkludert primære cellelinjer. Vår lab har tidligere demonstrert bruk av denne teknologien for stedsspesifikk transfeksjon av primær hippocampus neuronal kultur fra E18 dag gamle rotte og NIH-3T3 celler med eggerøre siRNA sekvenser og GFP plasmid 18, 19. Vi har også hatt suksess i å levere f...

<table border="1"><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> Cell media: Avansert MEM L-Glutamin 200 mM Penicillin / streptomycin Føtalt bovint serum </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia Laboratories / VWR Lonza Group Ltd Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Cell media sammensetning: 2% FBS, 2% L-glutamin og 2% Pennstrep i Advance MEM </td></tr><tr><td> Trypsin EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 og rhodamine merket kryptert sequhet siRNA </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporation buffer </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Bølgeform generator </td><td> Pragmatisk </td><td> 2414A </td><td> Hvilkensomhelst bølgeform / pulsgeneratoren som kan levere de ønskede pulser kan brukes. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

Oppdagelsen av RNAi vei i eukaryoter og den påfølgende utvikling av RNAi agenter, for eksempel siRNA og shRNA, har oppnådd en potent metode for stanse spesifikke gener 1-8 for funksjonell genomforskning og terapi. En stor utfordring i RNAi baserte studier er levering av RNAi midler til målrettede celler. Tradisjonelle ikke-virale levering teknikker som bulk elektroporering og kjemiske transfeksjon metodene ofte mangler den nødvendige romlige kontroll over produksjonstid og råd fattige transfeksjon effektivitet 9-12. Nylige fremskritt i kjemiske transfeksjon metoder som kationiske lipider, kationiske polymerer og nanopartikler har resultert i svært forbedret transfeksjon effektivitet 13. Men disse teknikkene fortsatt ikke klarer å tilby nøyaktig romlig kontroll over levering som kan umåtelig nytte miniatyrisert høy gjennomstrømming teknologier, encellede studier og undersøkelser av celle-celle interaksjoner. nt &quot;&gt; Nyere teknologiske fremskritt innen genet levering har aktivert high-throughput transfeksjon av tilhenger celler 14-23, et flertall av dem bruker mikroskala electroporation. mikroskala electroporation gir presis spatio-temporal kontroll over levering (opp til enkeltceller), og har vist for å oppnå høy effektivitet 19, 24-26. I tillegg gjør electroporation tilnærminger ikke krever en lengre inkubasjonstid (vanligvis 4 timer) med siRNA og DNA komplekser som nødvendig i kjemiske basert transfeksjon metoder og føre til direkte inntasting av naken siRNA og DNA molekyler i cellen cytoplasma. Som en konsekvens genuttrykk kan oppnås så tidlig som seks timer etter transfeksjon 27. Vår lab har tidligere demonstrert bruk av mikroelektroden arrays (MEA) for stedsspesifikk transfeksjon i adherente pattedyr cellekulturer 17-19. I MEA tilnærming, er levering av genetisk nyttelast oppnås via lokalisert mikro-skala electroporatipå av celler. En anvendelse av elektrisk puls til utvalgte elektroder genererer lokal elektrisk felt som fører til elektroporering av celler tilstede i regionen av de stimulerte elektroder. Den uavhengige styring av mikro-elektrodene gir romlige og tidsmessige kontroll over transfeksjon og også gjør at flere transfeksjon baserte forsøk som skal utføres på den samme kulturen øke eksperimentelle gjennomstrømming og redusere kultur til kultur variabilitet. Her beskriver vi den eksperimentelle oppsett og protokollen for målrettet transfeksjon av adherente HeLa celler med en fluorescently merket kryptert sekvens siRNA med electroporation. Samme protokoll kan også brukes for transfeksjon av plasmidvektorer. Tillegg kan protokollen beskrevet her enkelt kan utvides til en rekke pattedyr cellelinjer med mindre modifikasjoner. Kommersielt tilgjengelig MEAs med både forhåndsdefinerte og egendefinerte elektrodemønstrene gjøre denne teknikken tilgjengelig to fleste forskningslaboratorier med grunnleggende cellekultur utstyr.

Watch this Scientific Journal Video about High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA at JoVE.com

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Artikkelen detaljer protokollen for stedsspesifikk transfeksjon av kryptert sekvens av siRNA i en tilhenger pattedyrcelle kultur ved hjelp av en microelectrode array (MEA).

Høy effektivitet, stedsspesifikk Transfeksjon av tilhenger Celler med siRNA Bruke microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og Transfeksjon i Human kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av epidermal vekstfaktorreseptor målrettede Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Stedsspesifikk Bakteriell Chromosome Engineering: ΦC31 integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Engineering tilhenger bakterier ved å opprette en enkelt Syntetisk Curli operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

Kjennetegn på Nedbør-dannet polyetylenglykol Microgels er kontrollert av molekylvekt Reaktanter

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestilling av enkeltceller og enkelt Embryoet i 3D Confinement: En ny enhet for høyt innhold Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porøs Silicon Mikropartikler for levering av siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Enkel og nøyaktig Mekano-profilering på Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering av Terapeutisk siRNA til CNS Bruke kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering av effektiviteten og sikkerheten til morkaken målrettede narkotika-leveranser med tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Grensesnitt Microfluidics med Microelectrode matriser for å studere Neuronal kommunikasjon og Axonal Signal overføring

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...