Name: high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00
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1. MEA Preparación <ol><li> MEA para su uso en experimentos de electroporación puede ser fabricado utilizando la técnica de fotolitografía estándar como se describe anteriormente 18 o comprados directamente a los vendedores de los fabricantes de MEA, tales como sistemas de canales múltiples <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> y alfa MED Scientific Inc., <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Los AM...

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	<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems.">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).</li><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550 (2002).</li><li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells.">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo.">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).</li><li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).</li><li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ,+on+a+partly+conductive+slide.">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li><li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers.">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes.">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+(ethyleneimine)+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium?+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer.">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells.">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture.">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+(MEA)+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording.">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li><li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays.">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li><li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery.">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li><li>Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+high-throughput+electroporation+chips.">Efficient and high-throughput electroporation chips.</a> , (2011).</li><li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays.">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo.">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region.">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

En este artículo de vídeo que demuestran el uso de MEA para sitio específico de la transfección de células HeLa con revueltos secuencia de siRNA. Una de las ventajas de esta tecnología es su aplicabilidad a diferentes líneas celulares, incluyendo líneas celulares primarias. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de esta tecnología específica de sitio primario de la transfección de cultivo neuronal de hipocampo de rata E18 días de edad y células NIH-3T3 con revueltos secuencias de siRN...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Medios de comunicación celulares: Advanced MEM L-glutamina 200 mM Penicilina / Estreptomicina El suero fetal bovino </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia Laboratorios / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Celular medios composición: 2% de FBS, Pennstrep 2% de L-glutamina y 2% en Advance MEM </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 y rodamina etiquetados revueltos SEQUcia siRNA </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> La electroporación búfer </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Generador de forma de onda </td><td> Pragmático </td><td> 2414a </td><td> Cualquier forma de onda / generador de impulsos que puede entregar los pulsos deseado puede ser utilizado. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

El descubrimiento de la vía de RNAi en eucariotas y el posterior desarrollo de los agentes de ARNi, como siRNA y shRNA, han logrado un método potente para el silenciamiento de genes específicos de 1-8 para la genómica funcional y la terapéutica. Un reto importante involucrado en estudios basados ​​en RNAi es el suministro de agentes de ARNi a células diana. Tradicionales técnicas no víricas de envío, tales como electroporación grandes cantidades y métodos químicos de transfección a menudo carecen del control necesario espacial sobre la entrega y proporcionar eficiencias de transfección 9-12 pobres. Los recientes avances en los métodos de transfección químicas tales como lípidos catiónicos, polímeros catiónicos y nanopartículas han dado lugar a eficiencias de transfección muy mejoradas 13. Sin embargo, estas técnicas aún no ofrecen un control preciso espacial sobre la entrega que se pueden beneficiar inmensamente miniaturizado tecnologías de alto rendimiento, estudios de células individuales y la investigación de las interacciones célula-célula. nt &quot;&gt; avances tecnológicos recientes en la administración génica han permitido alto rendimiento de transfección de células adherentes 14-23, una mayoría de los cuales utilizan electroporación microescala. electroporación Microscale ofrece espacio-temporal preciso control sobre la entrega (hasta células individuales) y se ha demostrado para lograr altas eficiencias de 19, 24-26. Además, los enfoques basados ​​en la electroporación no requieren un prolongado período de incubación (típicamente de 4 horas) con complejos de DNA y siRNA como sea necesario en los métodos químicos de transfección basados ​​en y conducir a la introducción directa de ADN desnudo y siRNA moléculas en el citoplasma de la célula. Como consecuencia la expresión génica se puede lograr tan pronto como seis horas después de la transfección 27. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de matrices de microelectrodos (MEA) para sitio específico de transfección en cultivos celulares de mamíferos adherentes 17-19. En el enfoque basado en MEA, entrega de carga genética se logra a través de micro-escala localizada electroporatien las células. Una aplicación de pulsos eléctricos a los electrodos seleccionados genera el campo eléctrico local que conduce a la electroporación de células presentes en la región de los electrodos estimulados. El control independiente de los microelectrodos proporciona un control espacial y temporal sobre la transfección y también permite múltiples experimentos de transfección basados ​​en que se realizará en el mismo cultivo aumentando la producción experimental y la reducción de la cultura a la cultura variabilidad. Aquí se describe la configuración experimental y el protocolo para la transfección selectiva de adherentes células HeLa con un siRNA secuencia de marcado con fluorescencia codificado utilizando electroporación. El mismo protocolo también puede ser utilizado para la transfección de vectores de plásmido. Además, el protocolo aquí descrito puede extenderse fácilmente a una variedad de líneas celulares de mamíferos, con modificaciones menores. Disponibilidad comercial de los acuerdos ambientales multilaterales con modelos de electrodos tanto predefinidos y personalizados que este t técnica accesibleo La mayoría de los laboratorios de investigación con equipo básico de cultivo celular.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).

Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

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