Name: serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal New York State Department of Health (C026878). MS è stato a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Sostenuto in parte da assegno di ricerca n ° 5-FY11-571 dal March of Dimes Foundation.

1. Preparazione di cellule feeder Si noti che tutti i reagenti descritti di seguito devono essere preparati in modo sterile (vedi tavole 1 e 2). Questo protocollo utilizza la linea JK1 cella (Cell Biolabs, Inc., catalogo # CBA-315) come alimentatori che è un derivato trasformata di topo adulto testicolari cellule somatiche ed è stato descritto altrove 3. Si noti inoltre che tutte le procedure di polizia devono essere eseguite in c...

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	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1.">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li><li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro.">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li><li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling.">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li><li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female.">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals.">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li><li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation.">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li><li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice.">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).</li><li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2(+)+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice.">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li><li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells.">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li></ol>

Questo metodo per derivare SSC adulti con adulti testicolo derivate da cellule di alimentazione è robusto ed è riuscita quando comuni background genetico (ad esempio FVB, C57Bl6 e misti 129SV/C57Bl/6) e diversi ceppi mutanti sono stati impiegati 2,3,7,14. Infatti, il microambiente creato dal sistema di coltura è sufficiente a superare alcune delle barriere genetiche per mantenere SSCs adulti in vivo (ad esempio nel caso di PLZF - / - animali) 7. Mentre impieghiamo JK...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluente per la dissociazione del buffer </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Staminali base medio cellulare (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Richiede l&#39;integrazione come da Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> Staminali integratori medie cellulari </td><td> vario </td><td> vedi Tabella 3 </td><td> Richiede l&#39;integrazione come da Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 cellule </td><td> Cella Biolabs, Inc. </td><td> CBA-315 </td><td> Può sostituire con adulti cellule testicolari stromali come da Seandel et al. (2007) </td></tr><tr><td> mitomicina-C (ATTENZIONE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Tossico, Maneggiare con cura. </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> 0,4% soluzione in acqua </td></tr><tr><td> EVOS xl digitale microscopio invertito </td><td> Gruppo Microscopia Avanzata </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche. * Vedi Tabella 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluente per la dissociazione del buffer </td></tr><tr><td> tripsina (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Dissociazione buffer: finale 0,05% peso / vol </td></tr><tr><td> collagenasi di tipo I, 235 U / ml </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Dissociazione buffer: finale 0,03% peso / volume </td></tr><tr><td> DNAsi I </td><td> SIGMa-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Dissociazione buffer: Finale 80 U / ml </td></tr><tr><td> albumina di siero bovino </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Dissociazione buffer: Finale 0,5% peso / volume </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Dissociazione tampone </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 supplemento nutriente </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Supplementi aggiuntivi ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM Vitamina soluzione </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> albumina di siero bovino </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotica Solution </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) glucosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml </td></tr><tr><td> β-estradiolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> progesterone </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> siero fetale bovino </td><td> variabile </td><td> n / a </td><td> 1% </td></tr><tr><td> bovina olo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 pg / ml </td></tr><tr><td> insulina </td><td> Gemini Bio-Prodotti </td><td> 700-112P </td><td> 25 mg / ml </td></tr><tr><td> umano GDNF </td><td> Vita Techndologie </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> umana bFGF </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> del mouse FEG </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> putrescina </td><td> La ricerca Organics </td><td> 0778P </td><td> 60 pM </td></tr><tr><td> Selenite di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> acido piruvico </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 ug / ml </td></tr><tr><td> DL-lattico </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 pg / ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 pM </td></tr><tr><td> acido ascorbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 pM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-biotina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 3. Staminali media cella </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Nota: Aggiungere i supplementi di seguito prima di utilizzare il terreno. Filtro sterilizzare e mantenere a 4 ° C. Il medium è stabile per almeno 2 settimane. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Abbiamo impiegato diversi produttori, formulazioni e / o numeri di lotto di reagenti, senza apparenti effetti deleteri. In generale, i reagenti di grado coltura cellulare dovrebbe essere impiegato. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) del testicolo rappresentano un classico esempio di cellule staminali di mammifero e preservare la fertilità per quasi tutta la vita dell&#39;animale. Mentre i precisi meccanismi che governano self-renewal e la differenziazione in vivo sono difficili da studio, vari sistemi sono stati sviluppati in precedenza per propagare SSC murini in vitro utilizzando una combinazione di terreni di coltura e le cellule specializzate alimentazione 1-3. La maggior parte in incursioni in vitro sulla biologia della SSC hanno linee cellulari derivate da neonati, probabilmente a causa della difficoltà di ottenere linee di cellule adulte 4. Tuttavia, il testicolo continua a maturare fino a ~ 5 settimane di età in ceppi maggior parte dei mouse. Nel primo periodo post-natale, si verificano cambiamenti drammatici nell&#39;architettura dei testicoli e nella biologia delle cellule somatiche e sia spermatogenesi, incluse alterazioni nei livelli di espressione di cellule staminali numerosi correlatageni. Pertanto, neonatale-derivati ​​linee SSC potrebbero non ricapitolare la biologia della SSC adulti che persistono dopo che il testicolo adulto ha raggiunto uno stato stazionario. Diversi fattori hanno ostacolato la produzione di linee per adulti SSC storicamente. In primo luogo, la proporzione di cellule staminali funzionali può diminuire durante l&#39;età adulta, a causa di fattori intrinseci o estrinseci 5,6. Inoltre, come con altre cellule staminali adulte, è stato difficile per arricchire SSCs sufficientemente da cellule adulte totale testicolari senza utilizzare una combinazione di immunoselezione o altre strategie di smistamento 7. Strategie comunemente impiegati comprendono l&#39;uso di topi criptorchidi come fonte di cellule del donatore a causa di un alto rapporto di cellule staminali per altri tipi di cellule 8. Basata sull&#39;ipotesi che la rimozione di cellule somatiche dalla coltura iniziale interrompe interazioni con la nicchia delle cellule staminali che sono essenziali per la sopravvivenza SSC, abbiamo precedentemente sviluppato metodi per derivare l adultoines che non richiedono immunoselezione o donatori criptorchidi ma piuttosto impiegano arricchimento di serie SSC nella cultura, di seguito denominata SESC 2,3. Il metodo descritto di seguito comporta una semplice procedura per derivare adulti linee SSC dissociandosi adulto donatore tubuli seminiferi, seguito da placcatura su linee di cellule comprendenti una linea di cellule stromali testicolare (JK1) 3. Attraverso seriale passaging, fortemente aderente, contaminando le cellule germinali non sono esaurite dalla coltura con arricchimento concomitante di SSC. Culture prodotti in questo modo contengono una miscela di spermatogoni a diversi stadi di differenziazione, che contengono SSCS, basato su lungo termine capacità di rinnovamento del sé. Il punto cruciale del metodo SESC è che consente CSS per rendere la difficile transizione da self-renewal in vivo a lungo termine di auto-rinnovamento in vitro in un microambiente radicalmente diverso, produce a lungo termine linee SSC, libero di contaminarecellule somatiche, e consentendo in tal modo la successiva manipolazione sperimentale di SSC.

La comparsa di passaggio per lo zero di tipo selvatico, adulti colonie SSC dopo 7 giorni è mostrato in Figura 1. Tridimensionali colonie sono costituiti da uno strato di cellule piatte attaccate agli alimentatori o della matrice extracellulare underling depositati dagli alimentatori con strati multipli di SSCs crescono sopra. Mentre SSCs sani sono luminose e rifrangenti uniformemente 11-12 micron di diametro, i bordi delle celle sono difficili da distinguere e la dimensione delle colonie possono essere...

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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Un metodo semplice per ottenere e mantenere spermatogoni staminali e linee di cellule progenitrici da topi adulti è presentato qui. Il metodo utilizza cellule di alimentazione provenienti dal compartimento delle cellule somatiche del testicolo di topo adulto. Questa tecnica è applicabile ai ceppi di topi comuni, tra cui transgenici, knock-out e knock-nei topi.

Arricchimento di serie staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) in Cultura per la derivazione di lungo termine Lines topo adulto SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

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Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

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