Name: serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00
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이 작품은 건강의 뉴욕 국무부 (C026878)에 의해 지원되었다. MS는 뉴욕 줄기 세포 재단 - Druckenmiller 연구원이었다. 천 재단의 3 월부터 연구 기금 5 호 - FY11-571의 일부를 지원.

1. 피더 셀의 준비 아래에 설명 된 모든 시약은 (표 1 및 2 참조) 살균 방식으로 준비해야합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 고환 체세포 세포의 변화를 파생하고 다른 3 설명 된 피더로 JK1 세포주 (셀 Biolabs, 주식회사, 카탈로그 # CBA-315)를 사용하고 있습니다. 모든 동물 절차 기관 지침 및 규정에 따라 수행되어야한다고도합니다. <ol><li> JK1 세...

<ol>
	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1.">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li><li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro.">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li><li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling.">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li><li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female.">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals.">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li><li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation.">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li><li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice.">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).</li><li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2(+)+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice.">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li><li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells.">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li></ol>

성인 testis-파생 피더 세포를 사용하여 성인 SSCs를 파생를위한이 방법은 강력한이며, 일반적인 유전 적 배경 (예 : FVB, C57Bl6 및 혼합 129SV/C57Bl/6)과 다른 돌연변이 변종이 2,3,7,14을 고용했을 때 성공했습니다. 7 사실, 문화 시스템에 의해 생성 된 microenvironment는 생체에 성인 SSCs를 (- - / 동물 plzf의 경우 등) 유지에 유전 장벽의 일부를 극복하기에 충분합니다...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 코닝 </td><td> 10-013 </td><td> 해리 버퍼에 대한 희석제 </td></tr><tr><td> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Mediatech </td><td> 25-051 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 줄기 세포 기반 매체 (StemPro-34) </td><td> 생명 기술 </td><td> 10639-011 </td><td> Shinohara 외에 따라 보완이 필요합니다. (2003) * </td></tr><tr><td> 셀 중간 보충을 막기 </td><td> 여러 </td><td> 표 3을 참조하십시오 </td><td> Shinohara 외에 따라 보완이 필요합니다. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 세포 </td><td> 셀 Biolabs 주식회사 </td><td> CBA-315 </td><td> 당 Seandel 외 성인용 고환 stromal 세포로 대체 할 수 있습니다. (2007) </td></tr><tr><td> 미토 마이신-C (주의) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M4287 </td><td> 독성, 취급. </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G1890 </td><td> 물에 0.4 % 솔루션 </td></tr><tr><td> EVOS XL 디지털 역 현미경 </td><td> 고급 현미경 그룹 </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 특정 시약 및 장비. * 표 3을 참조 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 코닝 </td><td> 10-013 </td><td> 해리 버퍼에 대한 희석제 </td></tr><tr><td> 트립신 (1:250) </td><td> 생명 기술 </td><td> 27250-018 </td><td> 해리 버퍼 : 0.05 최종 % 중량 / 권 </td></tr><tr><td> collagenase는 235 U / ML을 I를 입력합니다 </td><td> 워싱턴 </td><td> CLS1 235 </td><td> 해리 버퍼 : 최종 0.03 % 중량 / 권 </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigm- 올드리치 </td><td> DN25 </td><td> 해리 버퍼 : 최종 80 U / ML </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> ICP 바이오 </td><td> 입 벌려 - 100g </td><td> 해리 버퍼 : 0.5 최종 % 중량 / 권 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 해리 버퍼 </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> 생명 기술 </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 영양소 보충 </td><td> 생명 기술 </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 요금 ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 가상 비타민 솔루션 </td><td> 생명 기술 </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 이 MM </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> ICP 바이오 </td><td> 벌려! </td><td> 0.50 % </td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic 솔루션 </td><td> Mediatech </td><td> 30-004 - CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) 포도당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G8769 </td><td> 6 MG / ML </td></tr><tr><td> β-에스트라 디올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E2758 </td><td> 30 NG / ML </td></tr><tr><td> progesterone </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 NG / ML </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 변하기 쉬운 </td><td> N / A </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 소 홀로 트랜스페린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T1283 </td><td> 100 μg / ML </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 쌍둥이 바이오 제품 </td><td> 700 112P </td><td> 25 μg / ML </td></tr><tr><td> 인간 GDNF </td><td> 생활 Technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> 인간 bFGF </td><td> 생명 기술 </td><td> PHG0023 </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> 마우스 EGF </td><td> 생명 기술 </td><td> PHG0313 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> putrescine </td><td> 연구 유기물 </td><td> 0778P </td><td> 60 μM </td></tr><tr><td> 나트륨 Selenite </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S5261 </td><td> 30 NM </td></tr><tr><td> pyruvic 산성 </td><td> 알파 Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 μg / ML </td></tr><tr><td> DL-젖산 </td><td> JT 베이커 </td><td> 0196-04 </td><td> 1 μg / ML </td></tr><tr><td> β-메르 캅토 에탄올 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21985-023 </td><td> 50 μM </td></tr><tr><td> 아스 코르 비 산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A4544 </td><td> 100 μM </td></tr><tr> &lt;TD&gt; D-비오틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> B4639 </td><td> 10 μg / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 3. 셀 매체를 줄기 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 참고 : 매체를 사용하기 전에 아래의 보충을 추가합니다. 필터 4 ° C.에 소독 및 보관 매체는 최소 2 주 동안 안정적이다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** 우리는 어떤 명백한 해로운 영향없이 다른 제조업체, 제제 및 / 또는 이러한 시약의 로트 번호를 고용했습니다. 일반적으로 세포 배양 등급 시약을 고용해야합니다. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Spermatogonial 줄기와 testis의 전구 세포는 (SSCs) 성인 포유류의 줄기 세포의 고전적인 예를 나타냅니다과 동물의 거의 평생 불임을 보존 할 수 있습니다. 생체에 자기 갱신과 차별화에 적용되는 정확한 메커니즘은 연구에 도전하고 있지만, 다양한 시스템은 전문 문화 미디어 및 1-3 피더 세포의 조합을 사용하여 체외에서 손쥐 SSCs를 전파하는 이전에 개발되었습니다. SSCs의 생물에 체외 forays의 대부분은 성인 세포 라인에게 4 취득의 어려움으로 인해 neonates에서 세포 라인을 도출했습니다. 그러나, testis는 대부분의 마우스 변종에 세 ~ 5 주가 지나야까지 성숙을 계속하고 있습니다. 초 후 산후 시대에는 극적인 변화가 testis의 아키텍처와 체세포와 많은 줄기 세포 관련의 표현 수준의 변경 등의 spermatogenic 세포, 모두의 생물학에서 발생유전자. 따라서 neonatally - 파생 SSC 라인이 완전히 성인 testis가 정상 상태에 도달 한 후 계속 성인 SSCs의 생물학을 요점을 되풀이하지 않을 수 있습니다. 여러 가지 요인이 역사적으로 성인 SSC 라인의 생산을 방해하고 있습니다. 첫째, 기능 줄기 세포의 비율은 고유 또는 외부 요인으로 인해 5,6하거나, 성인기 동안 감소 할 수 있습니다. 또한, 다른 성인의 줄기 세포와 마찬가지로, 그것은 immunoselection 또는 다른 정렬 전략 7의 조합을 사용하지 않고 전체 성인 고환 세포에서 충분히 SSCs을 풍요롭게하기 어려운되었습니다. 일반적으로 고용 전략은 다른 세포 유형 8 줄기 세포의 높은 비율로 인해 공여 세포의 원천으로 cryptorchid 마우스의 사용을 포함합니다. 초기 문화의 체세포 세포의 제거는 SSC의 생존에 필수적인 줄기 세포 틈새와의 상호 작용을 방해하는 가설을 바탕으로, 우리는 이전에 성인 리터를 추출하는 방법을 개발immunoselection 또는 cryptorchid 기증자를 필요로하지만, 오히려 문화에 SSCs의 일련 농축을 채용하지 않는 아이 네스는 SESC 2,3로 이하라고. 아래에서 설명하는 방법은 고환 stromal 세포 라인 (JK1) 3으로 구성 피더에 대한 세포의 도금에 이어 성인 기증자 정액을 운반하는 tubules를 dissociating하여 성인 SSC 라인을 파생하는 간단한 절차를 수반. 시리얼을 통해 비 배아 세포를 오염, 강하게 자기편, passaging 것은 SSCs의 수반하는 농축과 문화의 고갈됩니다. 이러한 방식으로 생산 문화는 장기적으로 자기 갱신 능력에 따라 SSCs를 포함하는 차별화의 다른 단계에서 spermatogonia의 혼합물을 포함합니다. SESC 방법의 요점은 그것이 근본적으로 다른 microenvironment의 체외에서 장기간 자기 갱신에 생체의 자기 갱신의 어려운 전환을 할 SSCs 수 있다는 것입니다, 오염 무료, 장기 SSC 라인을 생산체세포의 세포, 그리고이를 SSCs의 후속 실험 조작을 할 수 있습니다.

통로 제로 야생 타입의 외관, 7 일 후에 성인 SSC의 식민지는 그림 1에 표시됩니다. 입체 식민지가 상단에 성장 SSCs의 여러 레이어와 피더에 의해 증착 모이통 또는 부하 세포 외 기질에 부착 된 평면 세포의 층으로 구성되어 있습니다. 건강한 SSCs는 밝은 refractile하고 균일 11-12 μm의 직경 있지만, 셀 테두리는 구분하기가 어렵 있으며, 콜로니의 크기가 아니라 내에서 서로 다른 생쥐에서 ...

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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 - 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.

장기 성인 마우스 SSC 라인의 유도를위한 문화 Spermatogonial 줄기 및 전구 세포의 일련 농축 (SSCs)

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

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