Name: serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines at JoVE.com

Эта работа была поддержана штата Нью-Йорк Департамент здравоохранения (C026878). MS был в Нью-Йорке Stem Cell Foundation-Дракенмиллер Fellow. При частичной поддержке исследовательского гранта № 5-FY11-571 с марта Dimes Foundation.

1. Подготовка фидерных клеток Отметим, что все реагенты, описанные ниже, должны быть подготовлены в стерильной одежды (см. таблицы 1 и 2). Этот протокол использует JK1 клеточной линии (Cell Biolabs, Inc каталог # CBA-315) в качестве питателей, которая является производно...

<ol>
	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1.">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li><li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro.">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li><li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling.">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li><li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female.">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals.">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li><li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation.">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li><li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice.">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).</li><li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2(+)+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice.">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li><li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells.">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li></ol>

Этот способ для получения взрослого КСЭ использовании семенников взрослых клеток, полученных из питателя является надежной и удалось, когда общий генетический фон (например, FVB, C57BL6 и смешанных 129SV/C57Bl/6) и различные мутантные штаммы были заняты 2,3,7,14. В самом деле, микросреда с?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название Реагенты / Материал </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Гранулирование </td><td> 10-013 </td><td> Разбавитель для диссоциации буфера </td></tr><tr><td> Трипсин / ЭДТА </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-ДИ </td><td></td></tr><tr><td> Стволовые клетки базе среднего (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Требуется добавок в соответствии с Shinohara и соавт. (2003) * </td></tr><tr><td> Стволовые клетки добавки среде </td><td> различный </td><td> см. таблицу 3 </td><td> Требуется добавок в соответствии с Shinohara и соавт. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 клеток </td><td> Сотовые Biolabs, Inc </td><td> CBA-315 </td><td> Можно заменить взрослых яичка стромальных клеток в соответствии с Seandel и соавт. (2007) </td></tr><tr><td> митомицином-C (ВНИМАНИЕ) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Токсичные; Обращаться с осторожностью. </td></tr><tr><td> Желатин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> 0,4% раствор в воде </td></tr><tr><td> EVOS х цифровых инвертированным микроскопом </td><td> Advanced Group микроскопии </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 1. Конкретные реагентов и оборудования. * См. таблицу 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Гранулирование </td><td> 10-013 </td><td> Разбавитель для диссоциации буфера </td></tr><tr><td> трипсина (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Диссоциация буфера: Final 0,05% вес / объем </td></tr><tr><td> коллагеназы, тип I, 235 U / мл </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Диссоциация буфера: Final 0,03% вес / объем </td></tr><tr><td> ДНКазы </td><td> Сигм-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Диссоциация буфера: Final 80 U / мл </td></tr><tr><td> бычьего сывороточного альбумина </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100г </td><td> Диссоциация буфера: Final 0,5% вес / объем </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 2. Диссоциация буфер </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 Питательные добавки </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Дополнительные добавки ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Номера для незаменимых аминокислот </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM Витамин решения </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 мМ </td></tr><tr><td> бычьего сывороточного альбумина </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Антибиотик-противогрибковым решение </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-ДИ </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) глюкозы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 мг / мл </td></tr><tr><td> β-эстрадиола </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 нг / мл </td></tr><tr><td> прогестерон </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 нг / мл </td></tr><tr><td> эмбриональной бычьей сывороткой </td><td> переменная </td><td> N / A </td><td> 1% </td></tr><tr><td> бычьего голо-трансферрин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 мкг / мл </td></tr><tr><td> инсулин </td><td> Близнецы Bio-Products </td><td> 700-112P </td><td> 25 мкг / мл </td></tr><tr><td> GDNF человека </td><td> Жизнь Technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 нг / мл </td></tr><tr><td> человека шФРФ </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 нг / мл </td></tr><tr><td> мышь EGF </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 нг / мл </td></tr><tr><td> путресцина </td><td> Исследования Organics </td><td> 0778P </td><td> 60 мкМ </td></tr><tr><td> селенит натрия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 нМ </td></tr><tr><td> пировиноградная кислота </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 мкг / мл </td></tr><tr><td> DL-молочной кислоты </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 мкг / мл </td></tr><tr><td> β-меркаптоэтанола </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 мкМ </td></tr><tr><td> аскорбиновая кислота </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 мкМ </td></tr><tr> &lt;TD&gt; D-биотин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 3. Стволовые клетки среде </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Примечание: Добавить добавки ниже, прежде чем использовать среду. Фильтр стерилизовать и хранить его при температуре 4 ° C. Среда стабильна в течение по крайней мере 2 недели. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Мы использовали разные производители, формулировки, и / или номер лота этих реагентов без видимых вредных последствий. В общем, мобильный реагентов культуры классе должны быть использованы. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Появление прохождения нуля дикого типа, взрослый SSC колонии через 7 дней показано на рисунке 1. Трехмерная колонии состоят из слоя плоских клеток, прикрепленных к фидеров или подчиненного внеклеточного матрикса, сданный на хранение фидеров с несколькими слоями КСЭ, растущий на...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines at JoVE.com

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Простой метод для получения и поддержания сперматогониальные ствола и линии клеток-предшественников из взрослых мышей представлена ​​здесь. Метод использует фидерных клеток, происходящих из отсека соматической клетки взрослой семенников мышей. Этот метод применим к общим линий мышей, в том числе трансгенных, нокаут, и забивные мышей.

Серийный обогащению сперматогониальные стволовых и клеток-предшественников (SSC) в культуре Вывод Долгосрочные взрослых мышей линии Юг-Юг

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Вывод человеческих эмбриональных стволовых клеток на применение специфических иммунных сывороток в хирургии

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Вывод Мышь трофобласта стволовых клеток из бластоцист

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Выделение и Культура Стоматологическая эпителиальных стволовых клеток из взрослых мышей резца

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Остеокластов Вывод из костного мозга мыши

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...