Name: in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain at JoVE.com

Wir erkennen K. Mikic, der auf die Anfangsphase des Films und M. Nicolescu für die miR-Bild beigetragen. C. Huber wurde von einer Gemeinschaft des IZKF der Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand von der Fortune-Programm der Universtitätsklinikum Tübingen unterstützt.

1. Voraussetzungen für die In-ovo Elektroporation <ol><li> Vorbereiten des Vektorkonstrukt: miR Sense und Antisense-Primer wurden nach den Anweisungen des Ambion entworfen, geglüht und in ligiert ApaI / EcoRI verdaut pSilencer U6.1 Vektor. Nach einer erfolgreichen Transformation der erhaltenen Klone wurde angebaut und pSilencer Plasmid wurde durch alkalische Lyse isoliert mit einem Quiagen Midi Vorbereitung Kit. </li><li> Elektroden: Die Elektroden können gekauft werden od...

<ol>
	<li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA:+Knowns+of+the+unknown.">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li><li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs:+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases.">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li><li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. 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Dieses Video zeigt eine effektive Methode, um das Plasmid in die Neuroepithelzellen von bestimmten Bereichen des Mittelhirns Küken transfizieren. Rechteckige elektrische Impulse von Niederspannungs können DNA in Zellen der Küken Neuralrohr in ovo 6,16 einzuführen. Jedoch ist die Genauigkeit der DNA-Targeting oft durch die breiten elektrischen Feldes, das durch den relativ großen Elektroden (Φ = 0,5 mm) steigt behindert. Wir haben versucht, dieses Problem durch Verwendung von Elektroden im Durch...

Die Anerkennung der kleine nicht-kodierende RNAs als zusätzliche Spieler für die Genexpression eine neue Komplexität, um genomische Programmierung / Genregulation. Verschiedene Arten von nicht-kodierenden RNAs funktionelle Bedeutung in neuronalen Zellen, einschließlich der kleinen nicht-kodierenden RNAs 1-4. MicroRNAs (miR-oder miRNA) zeigen beispielsweise verschiedene und wechselnde Expressionsprofile in die Entwicklung des Gehirns 5. In ovo Elektroporation von Hühnerembryonen Gezielte bietet eine einzigartige Gelegenheit für zeitliche und räumliche Steuerung der Genexpression und der Silencing während der Entwicklung. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte der Durchführung ektopische Expression von miRs in bestimmten Bereichen des Mittelhirns mit Küken in ovo Elektroporation 10.06. Um eine dauerhafte Wirkung dieser kleinen nicht-kodierenden RNAs in den Zellen zu gewährleisten, wurden die DNA-Sequenz miRs in mono-oder bi-cistronischen Vektoren kloniert. Für die in-ovo Elektroporation, miR enthält vector in das Mittelhirn Neuralrohr, indem die Embryos nach einem kleinen Fenster in der Eierschale injiziert. Bestimmte Bereiche des Mittelhirns kleine Plus (Anode) und minus (Kathode) zu transfizieren Platinelektroden werden an bestimmten Positionen angeordnet. Zur ventralen Mittelhirn Transfektion wird die Anode unter dem ventralen Mittelhirn linken und der Kathode über der rechten Hälfte des Mittelhirns vor dem Anlegen eines Stroms angeordnet. Die Öffnung in der Eierschale ist mit Klebeband geschlossen und Embryonen werden, solange für jede Analyse erforderlich inkubiert. Dieses Verfahren wurde ursprünglich von Muramatsu et al. 6 beschrieben und Momose et al. 8 zum spezifischen Bereich der Transfektion verbessert. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> Schematische Übersicht. <ol><li> Der Embryo im Ei wird durch Schneiden ein kleines Fenster in th ausgesetzte Eierschale. </li><li> Das gelöste Vektor (en) in das Mittelhirn unter Verwendung einer Mikrokapillare injiziert. </li><li> Zwei Elektroden - parallel oder unter und über dem Embryo gelegt - erzeugen einen gepulsten elektrischen Feld. </li><li> Das elektrische Feld zeitlich erzeugt Poren in der Zellmembran, die den Eintritt in die Zelle durch die negativ geladene DNA (oder RNA) zu erleichtern zogen Anode 11,12. </li></ol>

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td></td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosillicate glass capillaries </td>
 <td>Hartenstein</td>
 <td></td>
 <td>Model: 0.9 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapillary puller</td>
 <td>WPI, Berlin</td>
 <td></td>
 <td>Model: Pul1-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporator</td>
 <td>Intracel</td>
 <td></td>
 <td>Model: TSSIC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope - fluorescence </td>
 <td>LEICA</td>
 <td></td>
 <td>Model: MZFLIII</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Stemi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera and software</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain

Nicht-kodierende RNAs sind weitere Spieler in der Regulation der Genexpression. In ovo Elektroporation von bestimmten Bereichen Gezielte bietet ein einzigartiges Werkzeug für die räumliche und zeitliche Kontrolle der Eileiter microRNA Expression. Allerdings sind ventralen Hirnstrukturen wie ventralen Mittelhirn ziemlich schwierig, für alle Manipulationen zu erreichen. Hier zeigen wir, eine effiziente Möglichkeit zum ventralen Mittelhirn miRNA in elektroporieren mit dünnen Platinelektroden. Dieses Verfahren bietet einen zuverlässigen Weg, um bestimmte Bereiche des Mittelhirns und nützliches Werkzeug für In-vivo-Studien zu transfizieren.

Der Umfang des Mittelhirns Bereich mit miR transfiziert ist durch die Expression von GFP aus einem Reportervektor zusammen mit der miR-Expressionsvektor (Abbildung 2) eingespritzt wird sichtbar. Verwendung von Platinelektroden mit einem Durchmesser von 0,5 mm und parallel zur Transfektion eines breiten Bereich entlang der DV-und AP-Achse, einschließlich Hinterhirn, Mittelhirn und Zwischenhirn manchmal (2A und B) angeordnet, um die AP-Achse des Mittelhirns führt normalerweise. Die Grö...

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In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ektopische Expression ist eine Technik, um die microRNAs Rolle in der Entwicklung des Gehirns aufzuklären. , Für bestimmte Bereiche mit in ovo Elektroporation ist jedoch eine Herausforderung. Hier zeigen wir einen effizienten Weg, um selektiv elektroporieren ventrale und dorsale Mittelhirn Regionen.

In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Forschung

Neurowissenschaften

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Umwelt Modulationen der Anzahl der Mittelhirn Dopamin-Neuronen in erwachsenen Mäusen

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...