Name: in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain at JoVE.com

Reconhecemos K. Mikic, que contribuiu para a fase inicial deste filme e M. Nicolescu para a imagem miR. C. Huber foi apoiado por uma bolsa da IZKF do Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand pelo programa fortuna do Universtitätsklinikum Tübingen.

1. Requisitos para in ovo Eletroporação <ol><li> Preparação da construção de vector: miR sentido e anti-sentido foram concebidos iniciadores após as instruções de Ambion, recozidos e ligados em Apal / EcoRI digerido pSilencer U6.1 vector. Após a transformação bem sucedida de um dos clones resultantes foram cultivadas e pSilencer plasmídeo foi isolado pelo método de lise alcalina, utilizando um kit de preparação Qiagen Midi. </li><li> Eletrodos: Eletrodos podem...

<ol>
	<li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA:+Knowns+of+the+unknown.">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li><li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs:+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases.">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li><li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. 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Este vídeo demonstra um método eficaz para transfectar plasmídeo nas células neuroepiteliais de áreas específicas do cérebro médio do pintainho. Pulsos elétricos retangulares de baixa tensão pode introduzir DNA em células do tubo neural garota em ovo 6,16. No entanto, a precisão da segmentação DNA é muitas vezes dificultada pela grande campo elétrico, que sobe através das relativamente grandes eletrodos (Φ = 0,5 mm). Nós tentamos resolver esse problema usando eletrodos menores em d...

O reconhecimento de pequenos RNAs não-codificantes como jogadores adicionais para a expressão do gene de lançar uma nova complexidade à regulamentação de programação / gene do genoma. Diferentes espécies de RNAs não-codificantes tem importância funcional em células neurais, incluindo pequeno RNAs não-codificantes 1-4. MicroRNAs (MIR ou miRNA), por exemplo, mostram perfis de expressão distintas e mutáveis ​​em cérebros em desenvolvimento 5. Alvejado em eletroporação in ovo de embriões de galinha oferece uma oportunidade única para o controle temporal e espacial da expressão gênica e silenciamento durante o desenvolvimento. Este vídeo demonstra as diferentes etapas da realização de expressão ectópica da RIM em áreas específicas do mesencéfalo garota usando eletroporação in ovo 6-10. Para assegurar um efeito de longa duração destes pequenos RNAs não-codificantes nas células, a sequência de ADN de RIM, foram clonados em vectores de mono-ou bi-cistronic. Pois em eletroporação in ovo, miR contendo vector é injectado no tubo neural mesencéfalo expondo o embrião depois de fazer uma pequena janela na casca do ovo. Para transfectar as áreas específicas do cérebro médio mais pequeno (ânodo) e negativo (cátodo) eléctrodos de platina são colocados em posições específicas. Para a transfecção do mesencéfalo ventral, o ânodo é colocado por baixo do mesencéfalo ventral esquerdo e o cátodo acima da metade direita do cérebro médio, antes de aplicar uma corrente. A abertura na casca do ovo é fechado com fita adesiva e os embriões foram incubados durante o tempo necessário para qualquer análise. Este método foi originalmente descrito por Muramatsu et al. 6 e melhorado por Momose et al. 8 para transfecção área específica. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> Visão esquemática. <ol><li> O embrião no ovo é exposta pelo corte de uma pequena janela em the casca de ovo. </li><li> O vector dissolvido (s) é injectado no mesencéfalo usando um tubo capilar de micro. </li><li> Dois eletrodos colocados - paralelo ou por baixo e por cima do embrião - gerar um campo elétrico pulsado. </li><li> O campo eléctrico temporalmente cria poros na membrana da célula, que facilitam a entrada na célula de ADN carregadas negativamente (ou RNA) atraídos para o ânodo 11,12. </li></ol>

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td></td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosillicate glass capillaries </td>
 <td>Hartenstein</td>
 <td></td>
 <td>Model: 0.9 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapillary puller</td>
 <td>WPI, Berlin</td>
 <td></td>
 <td>Model: Pul1-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporator</td>
 <td>Intracel</td>
 <td></td>
 <td>Model: TSSIC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope - fluorescence </td>
 <td>LEICA</td>
 <td></td>
 <td>Model: MZFLIII</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Stemi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera and software</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain

RNAs não-codificantes são jogadores adicionais na regulação da expressão gênica. Alvejado em eletroporação in ovo de áreas específicas fornece uma ferramenta única para o controle espacial e temporal da expressão do microRNA ectópica. No entanto, as estruturas cerebrais ventral como mesencéfalo ventral são bastante difíceis de alcançar por quaisquer manipulações. Aqui, nós demonstramos uma forma eficiente de electroporate miRNA em mesencéfalo ventral utilizando eletrodos de platina finas. Este método oferece uma maneira confiável de transfecção de áreas específicas do cérebro médio e uma ferramenta útil para estudos in vivo.

A extensão da área mesencéfalo transfectadas com miR é visível através da expressão de GFP a partir de um vector repórter injectado, juntamente com o vector de expressão de miR (Figura 2). Usando eléctrodos de platina com um diâmetro de 0,5 mm e colocado paralelamente ao eixo de AP de ligações mesencéfalo normalmente para a transfecção de uma área ampla e ao longo do eixo-DV AP, incluindo a parte posterior do cérebro, e por vezes mesencéfalo diencéfalo (Figuras 2A e B).</stro...

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In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

A expressão ectópica é uma técnica para elucidar o papel microRNAs no desenvolvimento do cérebro. No entanto, em áreas específicas usando a eletroporação in ovo é um desafio. Aqui, vamos mostrar uma maneira eficiente para regiões do mesencéfalo ventral e dorsal seletiva electroporate.

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Neurociência

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Um modelo em Ovo para testar compostos insulino-mimética

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...